Caratteristiche dell'uso della cromatografia liquida ad alte prestazioni nei prodotti farmaceutici. Cromatografia liquida ad alte prestazioni di inquinanti naturali e delle acque reflue Essenza della cromatografia liquida del metodo

"Cromatografia liquida ad alte prestazioni di inquinanti naturali e delle acque reflue"

introduzione

Capitolo 1. Concetti di base e classificazione dei metodi di cromatografia liquida

1.1 Apparecchio per cromatografia liquida

Capitolo 2. L'essenza dell'HPLC

2.1 Applicazione

Capitolo 3. Esempi di utilizzo dell'HPLC nell'analisi di oggetti ambientali

Capitolo 4 Strumentazione HPLC

Letteratura

Appendice

introduzione

Metodi cromatografici sono spesso indispensabili per l'identificazione e la quantificazione di composti organici con struttura simile. I più utilizzati per l'analisi di routine degli inquinanti ambientali sono i gas e la cromatografia liquida ad alte prestazioni. L'analisi gascromatografica degli inquinanti organici nelle acque potabili e reflue era inizialmente basata sull'uso di colonne impaccate, successivamente si sono diffuse anche le colonne capillari di quarzo. Il diametro interno delle colonne capillari è solitamente 0,20-0,75 mm, lunghezza - 30-105 M. I risultati ottimali nell'analisi dei contaminanti nell'acqua si ottengono più spesso quando si utilizzano colonne capillari con diversi spessori del film di siliconi metilfenile con un contenuto di fenile gruppi di 5 e 50%. Il sistema di iniezione del campione diventa spesso un punto vulnerabile nelle tecniche cromatografiche che utilizzano colonne capillari. I sistemi di iniezione del campione possono essere suddivisi in due gruppi: universali e selettivi. Quelli universali comprendono sistemi di iniezione con e senza frazionamento del flusso, iniezione “fredda” in colonna ed evaporazione con programmazione della temperatura. L'iniezione selettiva utilizza lo spurgo con intrappolamento intermedio, analisi dello spazio di testa, ecc. Quando si utilizzano sistemi di iniezione universali, l'intero campione entra nella colonna, con l'iniezione selettiva viene introdotta solo una certa frazione. I risultati ottenuti con l'iniezione selettiva sono significativamente più accurati, poiché la frazione che è entrata nella colonna contiene solo sostanze volatili e la tecnica può essere completamente automatizzata.

I rivelatori gascromatografici utilizzati nel monitoraggio degli inquinanti sono spesso suddivisi in rivelatori universali, che rispondono a ciascun componente nella fase mobile, e rivelatori selettivi, che reagiscono alla presenza di un determinato gruppo di sostanze con caratteristiche chimiche simili nella fase mobile. Quelli universali includono la ionizzazione di fiamma, l'emissione atomica, i rivelatori di spettrometria di massa e la spettrometria a infrarossi. I rivelatori selettivi utilizzati nell'analisi dell'acqua sono a cattura elettronica (selettivi per sostanze contenenti atomi di alogeno), termoionici (selettivi per composti contenenti azoto e fosforo), fotoionizzazione (selettivi per idrocarburi aromatici), rivelatore di conducibilità elettrolitica (selettivi per composti, contenenti alogeno , atomi di zolfo e di azoto). Le quantità minime rilevabili di sostanze vanno da nanogrammi a picogrammi al secondo.

Cromatografia liquida ad alta prestazione(HPLC) è un metodo ideale per la determinazione di un gran numero di composti termicamente instabili che non possono essere analizzati mediante gascromatografia. Attualmente, i moderni prodotti agrochimici, inclusi i carbonati di metile e gli insetticidi organofosforici, e altre sostanze non volatili, diventano spesso oggetto di analisi mediante cromatografia liquida. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sta guadagnando terreno tra gli altri metodi utilizzati nel monitoraggio ambientale, anche perché ha ottime prospettive in termini di automazione della preparazione dei campioni.

CAPO 1. CONCETTI FONDAMENTALI E CLASSIFICAZIONE DEI METODI DI CROMATOGRAFIA LIQUIDA

La cromatografia liquida è suddivisa in diverse classi a seconda del tipo di supporto di fase stazionaria. La semplice strumentazione di carta e la cromatografia su strato sottile hanno portato all'uso diffuso di questi metodi nella pratica analitica. Tuttavia, le grandi possibilità della cromatografia liquida su colonna hanno stimolato il miglioramento delle apparecchiature per questo metodo classico e hanno portato alla rapida introduzione dell'HPLC. Il passaggio dell'eluente attraverso la colonna ad alta pressione ha consentito di aumentare notevolmente la velocità di analisi e di aumentare significativamente l'efficienza di separazione grazie all'uso di un sorbente finemente disperso. Il metodo HPLC consente attualmente di isolare, analizzare quantitativamente e qualitativamente miscele complesse di composti organici.

In base al meccanismo di interazione della sostanza separata (eluato) con la fase stazionaria, si distinguono adsorbimento, distribuzione, scambio ionico, esclusione dimensionale, coppia ionica, scambio di ligando e cromatografia di affinità.

Cromatografia ad adsorbimento. La separazione mediante cromatografia ad adsorbimento viene effettuata come risultato dell'interazione della sostanza da separare con un adsorbente, come ossido di alluminio o gel di silice, che hanno centri polari attivi sulla superficie. Il solvente (eluente) è un liquido non polare. Il meccanismo di assorbimento consiste in una specifica interazione tra la superficie polare del sorbente e le regioni polari (o polarizzabili) delle molecole del componente analizzato (Fig. 1).

Riso. 1. Cromatografia liquida ad adsorbimento.

Cromatografia di partizione. Nella versione distributiva della cromatografia liquida, la separazione di una miscela di sostanze viene effettuata a causa della differenza dei loro coefficienti di distribuzione tra due fasi immiscibili: l'eluente (fase mobile) e la fase situata sul sorbente (fase stazionaria).

A fase normale La cromatografia liquida di partizione utilizza un eluente non polare e gruppi polari innestati sulla superficie di un assorbente (il più delle volte gel di silice). Gli alchilclorosilani sostituiti contenenti gruppi polari, come nitrile, gruppo amminico, ecc., sono usati come modificatori di superficie del gel di silice (fasi legate) (Fig. 2). L'uso di fasi legate consente di controllare finemente le proprietà di assorbimento della superficie della fase stazionaria e ottenere un'elevata efficienza di separazione.

Riso. 2. Cromatografia di partizione con fase legata (variante di fase normale).

fase invertita la cromatografia liquida si basa sulla distribuzione dei componenti della miscela tra l'eluente polare ei gruppi non polari (lunghe catene alchiliche) innestati sulla superficie del sorbente (Fig. 3).

Riso. 3. Cromatografia di partizione con fase legata (versione a fase inversa).

Meno ampiamente utilizzata è una variante della cromatografia liquida in fase supportata, in cui una fase stazionaria liquida viene applicata a un supporto stazionario.

Esclusivo (gel penetrante) La cromatografia è una variante della cromatografia liquida in cui la separazione delle sostanze avviene a causa della distribuzione di molecole tra il solvente situato nei pori del sorbente e il solvente che scorre tra le sue particelle.

affine La cromatografia si basa su interazioni specifiche di proteine separate (anticorpi) con sostanze (antigeni) innestate sulla superficie di un assorbente (resina sintetica) che formano selettivamente complessi (coniugati) con proteine.

La cromatografia a scambio ionico, a coppia ionica e a scambio di ligando viene utilizzata principalmente nell'analisi inorganica.

Parametri di base della separazione cromatografica.

I parametri principali della separazione cromatografica sono il volume di ritenzione e il tempo di ritenzione del componente della miscela (Fig. 4).

Il tempo di ritenzione tR è il tempo trascorso dal momento in cui il campione viene iniettato nella colonna fino al raggiungimento del massimo del picco corrispondente. Moltiplicando il tempo di ritenzione per la velocità del volume dell'eluente F, otteniamo il volume di ritenzione VR:

Il tempo di ritenzione corretto è il tempo trascorso dal momento in cui compare il picco del componente non assorbibile al picco del composto corrispondente:

tR" = tR - t0 ;

Il volume di ritenzione normalizzato o corretto è il volume di ritenzione corretto per il volume morto della colonna V0, ovvero il volume di ritenzione del componente non assorbibile:

VR" = VR - V0;

La caratteristica di ritenzione è anche il fattore di capacità k", definito come il rapporto tra la massa della sostanza in fase stazionaria e la massa della sostanza in fase mobile: k" = mn / mp;

Il valore di k" è facile da determinare dal cromatogramma:

I parametri più importanti della separazione cromatografica sono la sua efficienza e selettività.

L'efficienza della colonna, misurata dall'altezza delle piastre teoriche (HETP) ed inversamente proporzionale al loro numero (N), è tanto maggiore quanto più stretto è il picco della sostanza emergente a parità di tempo di ritenzione. Il valore di efficienza può essere calcolato dal cromatogramma utilizzando la seguente formula:

N = 5,54. (tR / 1/2) 2 ,

dove tR- tempo di attesa,

w 1/2 - larghezza del picco a metà altezza

Conoscendo il numero di piastre teoriche per colonna, la lunghezza della colonna L e il diametro medio del grano dc del sorbente, è facile ottenere i valori dell'altezza equivalente piastra teorica (HETP) e dell'altezza ridotta (PHETP):

HETP = L/N PHETP = HETP/g c

Queste caratteristiche consentono di confrontare l'efficienza di colonne di diverso tipo, di valutare la qualità del sorbente e la qualità del riempimento delle colonne.

La selettività della separazione di due sostanze è determinata dall'equazione:

Quando si considera la separazione di una miscela di due componenti, anche il grado di separazione RS è un parametro importante:

;

I picchi si considerano risolti se il valore RS è maggiore o uguale a 1,5.

I principali parametri cromatografici riguardano la seguente equazione per la risoluzione:

;

I fattori che determinano la selettività di separazione sono:

1) la natura chimica del sorbente;

2) la composizione del solvente e dei suoi modificatori;

3) struttura chimica e proprietà dei componenti della miscela da separare;

4) temperatura della colonna

1.1 Apparecchio per cromatografia liquida

Nella moderna cromatografia liquida vengono utilizzati strumenti di vari gradi di complessità, dai sistemi più semplici ai cromatografi di fascia alta dotati di vari dispositivi aggiuntivi.

Sulla fig. La figura 4 mostra uno schema a blocchi di un cromatografo liquido contenente l'insieme minimo richiesto di componenti, in una forma o nell'altra, presenti in qualsiasi sistema cromatografico.

Riso. 4. Schema a blocchi di un cromatografo liquido.

La pompa (2) è progettata per creare un flusso di solvente costante. Il suo design è determinato principalmente dalla pressione di esercizio nel sistema. Per il funzionamento nell'intervallo 10-500 MPa, vengono utilizzate pompe a pistone (siringa) oa pistone. Lo svantaggio del primo è la necessità di interruzioni periodiche per il riempimento con l'eluente e il secondo è la grande complessità del design e, di conseguenza, il prezzo elevato. Per sistemi semplici con basse pressioni di esercizio di 1-5 MPa, vengono utilizzate con successo pompe peristaltiche poco costose, ma poiché è difficile ottenere una pressione e una portata costanti, il loro utilizzo è limitato alle attività preparatorie.

L'iniettore (3) assicura che un campione della miscela di componenti separati venga iniettato nella colonna con una riproducibilità sufficientemente elevata. I semplici sistemi di iniezione del campione "stop-flow" richiedono l'arresto della pompa e sono quindi meno convenienti delle pipette ad anello di Reodyne.

Le colonne HPLC (4) sono tubi in acciaio inossidabile a pareti spesse in grado di resistere ad alte pressioni. Un ruolo importante è svolto dalla densità e dall'uniformità dell'impaccamento della colonna con un assorbente. Per la cromatografia liquida a bassa pressione, vengono utilizzate con successo colonne di vetro a pareti spesse. La costanza della temperatura è assicurata dal termostato (5).

I rivelatori (6) per cromatografia liquida hanno una cella a flusso in cui alcune proprietà dell'eluente fluente vengono misurate continuamente. I tipi più diffusi di rivelatori per uso generico sono i rifrattometri, che misurano l'indice di rifrazione, e i rivelatori spettrofotometrici, che misurano l'assorbanza di un solvente a una lunghezza d'onda fissa (di solito nella regione dell'ultravioletto). I vantaggi dei rifrattometri (e gli svantaggi degli spettrofotometri) includono una bassa sensibilità al tipo di composto da determinare, che potrebbe non contenere gruppi cromofori. D'altra parte, l'uso dei rifrattometri è limitato ai sistemi isocratici (con una composizione dell'eluente costante), quindi in questo caso non è possibile l'uso di un gradiente di solvente.

Le colonne HPLC, che sono più comunemente utilizzate nell'analisi degli inquinanti ambientali, sono lunghe 25 cm e hanno un diametro interno di 4,6 mm e sono riempite con particelle di gel di silice sferico di 5-10 µm innestate con gruppi ottadecile. Negli ultimi anni sono apparse colonne con diametri interni più piccoli riempite con particelle più piccole. L'uso di tali colonne riduce il consumo di solventi e la durata dell'analisi, aumenta la sensibilità e l'efficienza di separazione e facilita anche il problema del collegamento delle colonne ai rivelatori spettrali. Le colonne con un diametro interno di 3,1 mm sono dotate di una cartuccia di sicurezza (precolonna) per aumentare la durata e migliorare la riproducibilità delle analisi.

Come rivelatori nei moderni strumenti HPLC, vengono solitamente utilizzati un rivelatore UV su un array di diodi, rivelatori a fluorescenza e elettrochimici.

Va tenuto presente che nel lavoro pratico, la separazione spesso procede non per uno, ma per più meccanismi contemporaneamente. Quindi, la separazione per esclusione può essere complicata da effetti di adsorbimento, adsorbimento - distribuzione e viceversa. In questo caso, maggiore è la differenza delle sostanze presenti nel campione in termini di grado di ionizzazione, basicità o acidità, in termini di peso molecolare, polarizzabilità e altri parametri, maggiore è la probabilità di un diverso meccanismo di separazione per tali sostanze .

In pratica, è diventata più diffusa la cromatografia a "fase inversa" (di partizione), in cui la fase stazionaria non è polare, ma la fase mobile è polare (cioè l'inverso della cromatografia a "fase diritta").

Nella maggior parte dei laboratori di tutto il mondo, un gruppo di 16 IPA prioritari viene analizzato mediante HPLC o CMS.

CAPITOLO 2. ESSENZA DI HPLC

Nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), la natura dei processi che si verificano nella colonna cromatografica è generalmente identica ai processi della gascromatografia. La differenza sta solo nell'uso di un liquido come fase stazionaria. A causa dell'elevata densità delle fasi mobili liquide e dell'elevata resistenza delle colonne, la cromatografia gassosa e liquida differisce notevolmente nella strumentazione.

In HPLC, i solventi puri o le loro miscele vengono solitamente utilizzati come fasi mobili.

Per creare un flusso di solvente puro (o miscele di solventi), chiamato eluente in cromatografia liquida, vengono utilizzate le pompe, che fanno parte del sistema idraulico del cromatografo.

La cromatografia ad adsorbimento viene eseguita come risultato dell'interazione di una sostanza con adsorbenti, come gel di silice o ossido di alluminio, che hanno centri attivi sulla superficie. La differenza nella capacità di interagire con i centri di adsorbimento di diverse molecole campione porta alla loro separazione in zone nel processo di spostamento con la fase mobile attraverso la colonna. La divisione delle zone componenti ottenuta in questo caso dipende dall'interazione sia con il solvente che con l'adsorbente.

Gli adsorbenti in gel di silice con diversi volumi, superfici e diametri dei pori trovano la massima applicazione nell'HPLC. L'ossido di alluminio e altri adsorbenti sono usati molto meno frequentemente. Il motivo principale di questo:

Resistenza meccanica insufficiente, che non consente il confezionamento e l'utilizzo a pressioni elevate tipiche dell'HPLC;

il gel di silice rispetto all'ossido di alluminio ha una gamma più ampia di porosità, superficie e diametro dei pori; un'attività catalitica significativamente maggiore dell'ossido di alluminio porta ad una distorsione dei risultati dell'analisi a causa della decomposizione dei componenti del campione o del loro irreversibile chemisorbimento.

Rivelatori HPLC

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) viene utilizzata per rilevare sostanze polari non volatili, che per qualche motivo non possono essere convertite in una forma conveniente per la gascromatografia, anche sotto forma di derivati. Tali sostanze, in particolare, comprendono acidi solfonici, coloranti idrosolubili e alcuni pesticidi, come i derivati della fenilurea.

Rilevatori:

Rivelatore a matrice di diodi UV. La "matrice" di fotodiodi (ce ne sono più di duecento) registra costantemente i segnali nella regione UV e visibile dello spettro, garantendo così la registrazione degli spettri UV-B nella modalità di scansione. Ciò consente di registrare continuamente, ad alta sensibilità, spettri non distorti di componenti che passano rapidamente attraverso una cella speciale.

Rispetto al rilevamento a lunghezza d'onda singola, che non fornisce informazioni sulla "purezza" del picco, la capacità di confrontare gli spettri completi dell'array di diodi fornisce un risultato di identificazione con un grado di certezza molto maggiore.

Rivelatore fluorescente. La grande popolarità dei rivelatori fluorescenti è dovuta all'altissima selettività e sensibilità e al fatto che molti inquinanti ambientali emettono fluorescenza (ad esempio idrocarburi poliaromatici).

Un rivelatore elettrochimico viene utilizzato per rilevare sostanze facilmente ossidabili o ridotte: fenoli, mercaptani, ammine, nitro aromatico e derivati degli alogeni, aldeidi, chetoni, benzidine.

La separazione cromatografica della miscela sulla colonna a causa del lento avanzamento del PF richiede molto tempo. Per accelerare il processo, la cromatografia viene eseguita sotto pressione. Questo metodo è chiamato cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

La modernizzazione delle apparecchiature utilizzate nella cromatografia su colonna liquida classica ne ha fatto uno dei metodi di analisi moderni e promettenti. La cromatografia liquida ad alte prestazioni è un metodo conveniente per la separazione, l'isolamento preparatorio e l'esecuzione di analisi qualitative e quantitative di composti non volatili e termolabili a basso e alto peso molecolare.

A seconda del tipo di assorbente utilizzato in questo metodo, vengono utilizzate 2 varianti di cromatografia: su un assorbente polare utilizzando un eluente non polare (opzione di fase diretta) e su un assorbente non polare utilizzando un eluente polare - il cosiddetto reverse cromatografia liquida in fase ad alta prestazione (RPHLC).

Quando l'eluente passa all'eluente, l'equilibrio in condizioni RPHLC si stabilisce molte volte più velocemente che nelle condizioni di assorbenti polari e PF non acquosi. Di conseguenza, oltre alla comodità di lavorare con acqua ed eluenti acqua-alcol, RPHLC ha ora guadagnato grande popolarità. La maggior parte delle analisi HPLC vengono eseguite utilizzando questo metodo.

Rivelatori. La registrazione dell'uscita dalla colonna di un componente separato viene eseguita utilizzando un rilevatore. Per la registrazione è possibile utilizzare la variazione di qualsiasi segnale analitico proveniente dalla fase mobile e relativo alla natura e quantità della componente della miscela. La cromatografia liquida utilizza segnali analitici come l'assorbimento o l'emissione di luce della soluzione in uscita (rivelatori fotometrici e fluorimetrici), l'indice di rifrazione (rivelatori rifrattometrici), la conducibilità potenziale ed elettrica (rivelatori elettrochimici), ecc.

Il segnale continuamente rilevato viene registrato dal registratore. Il cromatogramma è una sequenza di segnali del rivelatore registrati sul nastro del registratore, generati quando i singoli componenti della miscela escono dalla colonna. Nel caso di separazione della miscela, i singoli picchi sono visibili sul cromatogramma esterno. La posizione del picco sul cromatogramma viene utilizzata ai fini dell'identificazione della sostanza, dell'altezza o dell'area del picco - ai fini della determinazione quantitativa.

2.1 Applicazione

L'HPLC trova la più ampia applicazione nelle seguenti aree dell'analisi chimica (vengono evidenziati gli oggetti di analisi in cui l'HPLC non ha praticamente concorrenza):

· Controllo della qualità degli alimenti - additivi tonici e aromatizzanti, aldeidi, chetoni, vitamine, zuccheri, coloranti, conservanti, ormoni, antibiotici, triazine, carbammati e altri pesticidi, micotossine, nitrosoammine, idrocarburi policiclici aromatici, ecc.

· Protezione dell'ambiente - fenoli, nitrocomposti organici, idrocarburi aromatici mono e policiclici, numerosi pesticidi, anioni principali e cationi.

· Criminalistica - droghe, esplosivi organici e coloranti, potenti prodotti farmaceutici.

· Industria farmaceutica - ormoni steroidei, praticamente tutti i prodotti di sintesi organica, antibiotici, preparati polimerici, vitamine, preparati proteici.

Medicina: le sostanze biochimiche e medicinali elencate e i loro metaboliti nei fluidi biologici (aminoacidi, purine e pirimidine, ormoni steroidei, lipidi) nella diagnosi delle malattie, determinando la velocità di escrezione dei farmaci dal corpo ai fini del loro dosaggio individuale .

· Agricoltura - determinazione di nitrati e fosfati nei suoli per determinare la quantità necessaria di fertilizzanti, determinazione del valore nutritivo dei mangimi (aminoacidi e vitamine), analisi dei pesticidi nel suolo, nell'acqua e nei prodotti agricoli.

Biochimica, chimica bioorganica, ingegneria genetica, biotecnologie - zuccheri, lipidi, steroidi, proteine, amminoacidi, nucleosidi e loro derivati, vitamine, peptidi, oligonucleotidi, porfirine, ecc.

· Chimica organica - tutti i prodotti stabili di sintesi organica, coloranti, composti termolabili, composti non volatili; chimica inorganica (praticamente tutti i composti solubili sotto forma di ioni e composti complessi).

· Controllo qualità e sicurezza di prodotti alimentari, bevande alcoliche e analcoliche, acqua potabile, prodotti chimici per la casa, profumi in tutte le fasi della loro produzione;

determinazione della natura dell'inquinamento nel luogo di una catastrofe o emergenza provocata dall'uomo;

rilevamento e analisi di sostanze stupefacenti, potenti, velenose ed esplosive;

determinazione della presenza di sostanze nocive (idrocarburi policiclici e altri idrocarburi aromatici, fenoli, pesticidi, coloranti organici, ioni di metalli pesanti, alcalini e alcalino terrosi) negli effluenti liquidi, nelle emissioni in atmosfera e nei rifiuti solidi delle imprese e negli organismi viventi;

· monitoraggio dei processi di sintesi organica, della lavorazione del petrolio e del carbone, delle produzioni biochimiche e microbiologiche;

analisi della qualità del suolo per la concimazione, della presenza di pesticidi ed erbicidi nel suolo, dell'acqua e dei prodotti, nonché del valore nutritivo dei mangimi; compiti analitici di ricerca complessi; ottenendo una micro quantità di sostanza ultrapura.

CAPO 3. ESEMPI DI UTILIZZO DELL'HPLC NELL'ANALISI DI OGGETTI AMBIENTALI

HPLC - un metodo per monitorare gli IPA negli oggetti ambientali

Per gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA), ecotossici della 1a classe di pericolo, sono stati stabiliti livelli estremamente bassi di concentrazioni massime consentite (MAC) negli oggetti naturali. La determinazione degli IPA a livello MPC e inferiore è uno dei compiti analitici molto complessi e per risolverli vengono utilizzati metodi di analisi ad alta tecnologia (GC-MS, GC, HPLC). Quando si sceglie un metodo per il monitoraggio, oltre alle principali caratteristiche in esame, si aggiungono sensibilità e selettività, espressività ed economia, perché. il monitoraggio implica un'analisi seriale. La variante HPLC su colonne corte di piccolo diametro soddisfa ampiamente questi requisiti. Utilizzando questo metodo, gli autori hanno sviluppato e certificato metodi per il monitoraggio del benzo[a]pirene in tre mezzi naturali: aerosol, manto nevoso e acque superficiali. I metodi sono caratterizzati da: semplice preparazione unificata del campione, inclusa l'estrazione di IPA con solventi organici e concentrazione dell'estratto, introduzione diretta di un estratto concentrato in una colonna cromatografica, utilizzo del rilevamento fotometrico a lunghezza d'onda multiplo nella regione UV dello spettro, identificazione di picchi IPA nei cromatogrammi utilizzando due parametri, tempo di ritenzione e rapporto spettrale. L'errore totale non supera il 10% quando si determina il benz[a]pirene nell'aerosol nell'intervallo di concentrazione da 0,3 a 450 ng/m fino a 50 μg/m 2. Per il caso di determinazione simultanea degli IPA prioritari (fino a 12 composti) e registrazione di picchi disomogenei di analiti, è stato proposto di separare l'estratto con una variazione della selettività della fase mobile, della lunghezza d'onda di rilevamento e della temperatura della colonna, tenendo conto delle singole proprietà dell'IPA in corso di determinazione.

1 . Qualità dell'aria ambiente. Concentrazione di massa di benzo[a]pirene. La procedura per eseguire misurazioni con il metodo HPLC. Certificato di attestazione MVI n. 01-2000.

2 . La qualità delle acque reflue superficiali e trattate. Concentrazione di massa di benzo[a]pirene. La procedura per eseguire misurazioni con il metodo HPLC. Certificato di attestazione MVI n. 01-2001.

3 . Qualità del manto nevoso. Concentrazione di massa di benzo[a]pirene. La procedura per eseguire misurazioni con il metodo HPLC. Certificato di attestazione MVI n. 02-2001.

Rimozione di anilina da soluzioni acquose utilizzando rifiuti di recupero alluminotermico di scaglie di rame laminate

Il problema della rimozione degli idrocarburi dalle acque reflue è un compito urgente. In molte industrie chimiche, petrolchimiche e di altro tipo si formano anilina e suoi derivati, che sono sostanze tossiche. L'anilina è una sostanza altamente tossica, MPC - 0,1 mg / m 3. L'anilina ei suoi derivati sono solubili in acqua e quindi non possono essere rimossi per decantazione gravitazionale.

Uno dei migliori metodi di trattamento delle acque reflue da inquinanti organici è l'utilizzo di adsorbenti inorganici e organici capaci di rigenerazione (alluminosilicati, argille modificate, legno, fibre, ecc.) e incapaci di rigenerazione (carbone attivo, materiali polimerici macroporosi, ecc.) . ).

Gli adsorbenti rigenerati possono rimuovere dall'acqua sostanze organiche di diversa polarità. La ricerca di efficaci adsorbenti è un compito urgente.

Questo rapporto presenta i risultati di uno studio nel campo dell'utilizzo della scala di rame fresato dell'impianto di cavi di Yerevan (OPMOERKZ) come assorbenti all'anilina.

Gli studi cromatografici sono stati effettuati su un cromatografo HPLC / cromatografia liquida ad alte prestazioni / sistemi (Waters 486 - detector, Waters 600S - controller, Waters 626 - Pump), su una colonna di 250 x 4 mm riempita con assorbenti in studio, velocità di fase mobile 1 ml/m / fase mobile sono i solventi che stiamo studiando/, il rivelatore è UV-254. L'analisi spettroscopica UV è stata eseguita su uno spettrofotometro Specord-50, gli spettri sono stati ottenuti utilizzando il programma per computer ASPECT PLUS.

A determinati volumi di anilina in acqua sono state aggiunte porzioni di assorbenti pesate con precisione, le cui concentrazioni iniziali variavano. La miscela è stata accuratamente agitata per 6 ore, quindi il campione è stato lasciato riposare. L'adsorbimento è completato in quasi 48 ore La quantità di anilina precipitata è stata determinata mediante spettrofotometria UV e analisi rifrattiva.

Inizialmente, le proprietà di adsorbimento di OPMOEPKZ sono state studiate durante la rimozione dell'anilina da una soluzione in tetracloruro di carbonio. Si è scoperto che l'anilina assorbe meglio l'assorbente 3 (tabella).

Sono state effettuate misurazioni anche per soluzioni acquose di anilina a concentrazioni di 0,01-0,0001 mol/l. La tabella mostra i dati su una soluzione 0,01 M.

Assorbimento di anilina da parte di vari assorbenti da soluzione acquosa 0,01 M di anilina a 20°C

In precedenza, è stato riscontrato che l'adsorbimento entro gli intervalli di concentrazione indicati aumenta e dipende linearmente dall'indice di rifrazione. La quantità di anilina è stata determinata dal grafico dell'indice di rifrazione rispetto alla concentrazione molare e corretta sia per la cromatografia liquida che per l'analisi spettrale UV.

Il Sorbent 3 è il più attivo per soluzioni acquose La quantità di inquinante adsorbito è stata calcolata come differenza tra la quantità totale di inquinante aggiunto alla soluzione iniziale e il suo residuo nella soluzione finale.

Metodi per la determinazione degli IPA negli oggetti ambientali

Tipicamente, per determinare gli IPA vengono utilizzati i metodi della gascromatografia (GC) e della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). la separazione dei 16 principali IPA, sufficiente per l'analisi quantitativa, si ottiene utilizzando colonne capillari in gascromatografia o colonne ad alte prestazioni utilizzate in HPLC. Va ricordato che una colonna che separi bene le miscele di calibrazione di sedici IPA non garantisce che saranno ben separate anche sullo sfondo dei composti organici di accompagnamento nei campioni in studio.

Per semplificare l'analisi, nonché per ottenere un'elevata qualità dei risultati ottenuti, la maggior parte delle procedure analitiche contengono la fase di isolamento preliminare (separazione) degli IPA da altri gruppi di composti correlati nei campioni. I metodi più comuni utilizzati a questo scopo sono la cromatografia liquida a bassa pressione in sistemi liquido-solido o liquido-liquido che utilizzano meccanismi di adsorbimento, come l'utilizzo di gel di silice o allumina, a volte vengono utilizzati meccanismi misti, come l'adsorbimento e l'esclusione utilizzando Sephadex.

L'uso del pretrattamento dei campioni consente di evitare l'influenza di:

Composti completamente apolari come gli idrocarburi alifatici;

Composti moderatamente e fortemente polari, ad esempio ftalano, fenoli, alcoli polivalenti, acidi;

Composti ad alto peso molecolare come, ad esempio, resine.

Nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) vengono utilizzati principalmente due tipi di rivelatori: un rivelatore fluorimetrico o un rivelatore spettrofotometrico a barra fotodiodo. Il limite di rivelazione degli IPA nella rivelazione fluorimetrica è molto basso, il che rende questo metodo particolarmente adatto per la determinazione di tracce di composti poliaromatici. Tuttavia, i rivelatori fluorimetrici classici non forniscono praticamente alcuna informazione sulla struttura del composto in studio. I design moderni consentono di registrare spettri di fluorescenza che sono caratteristici dei singoli composti, ma non si sono ancora diffusi nella pratica delle misurazioni di routine. Un rivelatore spettrofotometrico con una linea di fotodiodo (PDL) consente di registrare spettri di assorbimento nell'intervallo spettrale UV e visibile, questi spettri possono essere utilizzati per l'identificazione. Informazioni simili possono essere ottenute utilizzando rilevatori a scansione rapida.

Quando si sceglie una tecnica analitica per la separazione, l'identificazione e la quantificazione di questi IPA, devono essere prese in considerazione le seguenti condizioni:

Il livello dei contenuti determinati nei campioni studiati;

Il numero di sostanze correlate;

Procedura analitica applicata (procedura di misurazione);

Possibilità dell'attrezzatura seriale.

Sviluppo di un metodo per la determinazione di elementi alcalino terrosi e magnesio mediante cromatografia liquida ionica ad alte prestazioni

Lo sviluppo e il miglioramento di metodi che consentono di risolvere i problemi di analisi dell'acqua è un problema importante nella chimica analitica. Lo sviluppo della cromatografia liquida ad alta pressione ad alte prestazioni ha stimolato lo sviluppo di una nuova direzione nella cromatografia a scambio ionico, la cosiddetta cromatografia ionica. La sintesi di assorbenti per cromatografia ionica è difficile, poiché vengono imposti molti requisiti. A causa della mancanza di scambiatori cationici ad alte prestazioni disponibili in commercio, è stata utilizzata una fase inversa modificata dinamicamente, per la quale è stato sintetizzato un modificatore: acido N-esadecil-N-decanoil-para-ammino-benoilsolfonico etil-diisopropilammonio (DGDASC), dove l'ammina idrofobica contenente il gruppo SO 3, capace di scambio cationico. Dopo aver passato la soluzione del modificatore, l'assorbimento a l = 260 nm ha raggiunto 6,4 unità di densità ottica (° E) raggiungendo un plateau. La capacità di scambio ionico calcolata è 15,65 µmol. Poiché i cationi degli elementi alcalino terrosi e del magnesio non vengono assorbiti nella regione UV dello spettro, è stata utilizzata la rivelazione UV indiretta utilizzando l'eluente sintetizzato che assorbe gli UV 1,4-dipiridinio butano bromuro (DPB bromuro). Poiché gli ioni alogeno distruggono le parti in acciaio della colonna, lo ione bromuro di 1,4-dipiridinio butano è stato sostituito da uno ione acetato. Quando la colonna viene lavata con eluente, il controione del modificatore, etildiisopropilammonio, viene sostituito dallo ione assorbente gli UV 1,4-dipiridiniobutano. La separazione dei cationi è stata effettuata alla lunghezza d'onda ottimale l = 260 nm su una scala di 0,4 A in modalità “scale folding”; la polarità del registratore è stata invertita. La separazione di tutti i cationi studiati è stata ottenuta con l'introduzione di un additivo complessante: l'acido ossalico. I limiti di rivelazione di Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ sono 8 μg/l; 16 µg/l; 34 µg/l; 72 µg/l, rispettivamente. Nelle condizioni selezionate è stata analizzata l'acqua del rubinetto, il cui contenuto di Ca 2+ in cui è 10,6 +1,9 mg-ione/l, Mg 2+ -2,5 + mg-ione/l. L'errore di riproducibilità non supera -2,2% per Ca 2+ e 1,4% per Mg 2+.

Analisi dei complessi di cadmio nell'ambiente

Per studiare i meccanismi di migrazione dei metalli pesanti nella biosfera sono necessari dati sulle forme chimiche dell'esistenza dei metalli in natura. Le difficoltà nell'analisi dei composti di uno dei metalli più tossici - il cadmio - sono associate al fatto che forma complessi instabili e quando si tenta di isolarli, gli equilibri naturali vengono distorti. In questo lavoro sono stati studiati i composti del cadmio nel suolo e nelle piante utilizzando una tecnica basata sulla separazione cromatografica degli estratti seguita dall'identificazione dei componenti mediante analisi chimica. Questo approccio ha permesso non solo di identificare le forme chimiche del cadmio, ma anche di tracciarne le trasformazioni in oggetti ambientali.

I gruppi OH di carboidrati e polifenoli (compresi i flavonoidi), C=O, fosfati, NH 2 , NO 2 , i gruppi SH sono coordinati con il cadmio negli oggetti della biosfera. Ai fini di questo studio, è stata compilata una serie di ligandi modello che rappresentano queste classi di composti. L'interazione di ligandi modello con sali di cadmio idrosolubili è stata studiata mediante spettroscopia UV e HPLC.

Per isolare i composti di cadmio, è stata utilizzata l'estrazione con solventi appositamente selezionati (che non formano complessi con Cd). In questo modo, il cadmio può essere separato da tutti i metalli pesanti, ad eccezione del suo stretto analogo chimico, lo zinco. I picchi contenenti cadmio e zinco nei cromatogrammi degli estratti ottenuti sono stati rilevati legando i metalli sotto forma dei loro ditizonati. Per separare dallo zinco è stata utilizzata la differenza di stabilità dei complessi Cd e Zn a pH 6–8. I composti Cd isolati sono stati identificati mediante HPLC con variazioni di pH durante l'eluizione. È stata eseguita un'analisi dei composti del cadmio con componenti del suolo e tessuti vegetali e sono state identificate le sostanze prodotte dalle piante in risposta all'aumento dell'assunzione di cadmio dal suolo. È stato dimostrato che i flavonoidi, in particolare la tricina, sono agenti protettivi nei cereali, alcossiderivati della cisteina nei legumi, e sia polifenoli che tioli nelle piante crocifere.

CAPITOLO 4. APPARECCHIATURE HPLC

SERIE ACCELA

Il nuovo cromatografo liquido ad altissime prestazioni ACCELA è in grado di operare su un'ampia gamma di portate e pressioni, fornendo sia separazioni HPLC tipiche su colonne convenzionali sia separazioni ultraveloci ed efficienti su colonne con una dimensione delle particelle di assorbente inferiore a 2 µm a pressioni elevatissime (maggiori di 1000 atm.).

Il sistema include una pompa inerte a gradiente quaternario in grado di fornire pressioni superiori a 1000 atm e con un volume di ritardo di soli 65 µl, fornendo separazioni cromatografiche ad alta velocità. Campionatore automatico ACCELA in grado di funzionare in un ciclo di iniezione del campione di 30 secondi e offre la massima riproducibilità dell'iniezione. Rilevatore di serie di diodi Accela palmare con un volume della cella a flusso ridotto al minimo (2 µl) è ottimizzato per la cromatografia ad alta velocità, utilizza la tecnologia brevettata LightPipe e mantiene la forma del picco simmetrica che viene fornita con un sistema cromatografico e colonne impeccabili.

Il sistema si accoppia perfettamente con gli spettrometri di massa per creare i più potenti e migliori sistemi LC/MS disponibili al mondo.

Colonne UHP da 1,9 µm disponibili da Thermo Electron per tutte le applicazioni

SERIE TSP

Il principio modulare di costruzione degli strumenti HPLC consente al cliente di completare in modo flessibile le apparecchiature per la risoluzione di eventuali problemi analitici e, quando cambiano, possono essere modificate in modo rapido ed economico. L'ampia gamma di moduli comprende pompe da isocratico a gradiente quaternario, da microcolonna a semi-preparativo, tutti i rivelatori disponibili, sistemi di iniezione di campioni da iniettori manuali ad autocampionatori con la capacità di gestire qualsiasi campione, potente software per l'elaborazione dei risultati di misura e la gestione tutti i moduli del sistema. Tutti i moduli sono certificati secondo CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, sono compatti, hanno un design moderno, sono facili da usare, dotati di display integrato e auto- sistema diagnostico, consentono di creare e memorizzare metodi di attività nei parametri di memoria. Soddisfano i criteri della "prassi di laboratorio esemplare" (BPL) e sono elencati nel Registro degli strumenti di misura della Federazione Russa. I protocolli di misurazione sono emessi in conformità con le Farmacopee di Inghilterra, USA, Germania e Francia.

I sistemi modulari TSP sono caratterizzati dalla massima affidabilità e stabilità di funzionamento.

La combinazione di moduli fornisce all'analista tutti i vantaggi di un sistema integrato da un lato e la flessibilità di un sistema modulare dall'altro. Qualunque sia il campo di applicazione della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) - farmacologia, biotecnologia, analisi ambientale, analisi clinica, analisi di alimenti e bevande, analisi petrolchimica e chimica - questo strumento viene utilizzato, è sempre configurato in modo ottimale per soddisfare i requisiti più elevati .

Sia la ricerca che i sistemi di routine ad alte prestazioni forniscono:

Degasaggio del solvente ad alta efficienza

Capacità di lavorare con quantità di campione piccole e ultra-piccole

Massima sensibilità, sia con rivelatore UV/VIS che diode array (con la famosa tecnologia LightPipe con possibilità di scelta tra 1 o 5 cm di lunghezza del percorso ottico)

Lavorare con colonne diverse

Massima precisione quantitativa

Possibilità di lavoro automatico con diversi volumi di campione

Errore del tempo di ritenzione RMS inferiore allo 0,3%

L'area di lavoro minima occupata dal sistema

Massima affidabilità e stabilità dei parametri.

Pompa LC per geometra- Una pompa HPLC con la migliore riproducibilità del tempo di ritenzione di qualsiasi pompa a gradiente a 4 componenti disponibile al mondo. Un sistema di degasaggio sottovuoto a quattro canali integrato e uno smorzatore di pulsazioni forniscono un'eccellente stabilità della linea di base per la massima sensibilità e precisione di quantificazione.

L'autocampionatore offre le massime prestazioni e flessibilità di analisi. Un'ampia gamma di portacampioni, dalle fiale standard alle micropiastre da 96 e 384 pozzetti, copre le esigenze di praticamente tutte le applicazioni. La nuova tecnologia non fornisce praticamente alcuna perdita di iniezione del campione, praticamente 5 µl di campione vengono iniettati con un autocampionatore da un volume totale di campione di 5 µl.

geometra

Rilevatore UV/Visivo e PDA (Diode Array Detector)

Geometra UV/Vis- Il rivelatore di luce ultravioletta e visibile a lunghezza d'onda variabile è una combinazione di economia e affidabilità con la massima sensibilità della tecnologia LightPipe. Un'ampia selezione di celle di flusso rende questo rivelatore versatile per tutte le applicazioni, da quelle che utilizzano la cromatografia capillare o su microcolonne a quelle semi-preparative e preparative.

Geometra PDA Il rivelatore è il più sensibile tra tutti i rivelatori a serie di diodi HPLC. L'ottica a doppia lampada copre perfettamente l'intera gamma di lunghezze d'onda da 190 a 800 nm. Il beamformer in fibra ottica fornisce un'eccellente risoluzione ottica senza sacrificare la sensibilità.

Geometra RI rivelatore rifrattometrico con cuvetta termostatata a volume minimo con controllo completamente elettronico da computer.

Geometra FL rivelatore a scansione fluorometrica con la massima sensibilità e capacità di rilevamento per fluorescenza, chemiluminescenza e fosforescenza.

Un'ampia gamma di autocampionatori consente di lavorare sia con fiale convenzionali che con piastre a 96 posizioni, ampiamente utilizzate nella biochimica e nella pratica clinica. La manipolazione è facilitata dall'uso di piastre di preparazione del campione SPE simili.

400 Azionamento elettrico, loop Valco (20 µl - standard) con possibilità di riempimento parziale.

Carosello 96 campioni.

Azionamento elettrico, termostato a colonna, loop Valco (100 µl - standard) con possibilità di riempimento parziale Modalità AutoMix per la preparazione del campione. Carosello campioni: 84 x 2 ml (campioni) + 3 x 10 ml (reagenti). Termostato a colonna integrato. 420

Autocampionatore ad anello per lavori di ricerca con la possibilità di lavorare nelle modalità di riempimento completo, parziale e introduzione di campioni di microlitri. Una vasta gamma di caroselli (standard - 96 campioni).

Autocampionatore tablet per piastre da 96 e 384 posizioni. Iniezione del campione nel circuito di pressione, possibilità di introdurre campioni inferiori a 1 µl. Possibilità di installare un alimentatore per tablet. HPLC

Principali produttori di apparecchiature HPLC

· Acque - cromatografia ad alta prestazione, spettrometria di massa, colonne, estrazione in fase solida;

Varian, Inc. - cromatografi e colonne, accessori per estrazione in fase solida;

· Agilent Technologies - cromatografi e colonne;

· Hypersil - colonne e assorbenti.

· Merck KGaA - Piastre TLC e accessori per TLC, colonne, assorbenti fasi mobili per HPLC, accessori per estrazione in fase solida

· Dionex - apparecchiature e colonne per HPLC, in particolare per cromatografia ionica.

Letteratura

1.Pilipenko AT, Pyatnitsky IV Chimica analitica. In due libri: kn..1 - M.: Chimica, 1990, -480s.

1. Pilipenko AT, Pyatnitsky IV Chimica analitica. In due libri: kn..2 - M.: Chimica, 1990, -480s.

2. Vasiliev VP Chimica analitica. Alle 14 Parte 2. Metodi fisici e chimici di analisi: Proc. per Khimko - tecnologia. specialista. università. - M.: Più in alto. scuola, 1989. - 384p.

3. Materiali idrochimici. Volume 100. Metodi e mezzi tecnici di monitoraggio operativo della qualità delle acque superficiali. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. - 200p.

4. Lurie Yu.Yu. Chimica analitica delle acque reflue industriali / Yu.Yu. Luria; M.: Chimica Yu, 1984. - 448s.

5. Ewing G. Metodi strumentali di analisi chimica / Per. dall'inglese. M.: Mir, 1989. - 348 pag.

6. Gorelik DOC, Konopelko LA, Pankov E.D. Monitoraggio ambientale. In 2 voll. San Pietroburgo: Natale. 2000. - 260 pag.

7. Aivazov B.V. Introduzione alla cromatografia. M.: Più in alto. scuola, 1983. - 450 p.

8. Goldberg K.A., Vigdergauz MS. Introduzione alla gascromatografia. M.: Chimica, 1990. - 329 p.

9. Stolyarov B.V. e altri // Gascromatografia pratica e liquida. San Pietroburgo: Università statale di San Pietroburgo, 1998. - S. 81.

11. Gorshkov A.G., Marinaite I.I. HPLC - un metodo per monitorare gli IPA negli oggetti ambientali

12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O. Rimozione di anilina da soluzioni acquose utilizzando prodotti di scarto della riduzione alluminotermica della laminazione di scaglie di rame

13. LA Turkina, GN Koroleva Sviluppo di un metodo per la determinazione di elementi alcalino terrosi e magnesio mediante cromatografia liquida ionica ad alta prestazione

14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Analisi dei complessi di cadmio nell'ambiente

Appendice

DETERMINAZIONE DEL CLOMAZONE IN ACQUA MEDIANTE METODI CROMATOGRAFICI

ISTRUZIONI METODOLOGICHE MUK 4.1.1415-03

1. A cura di: Centro Scientifico Federale per l'Igiene. FF

Erisman; Accademia Agraria di Mosca. K.A.

Timiryazev; con la partecipazione del Dipartimento di sorveglianza sanitaria ed epidemiologica dello Stato del Ministero della Salute della Russia. Gli sviluppatori della metodologia sono elencati alla fine.

3. Approvato dal medico sanitario capo dello Stato

Federazione Russa, Primo Vice Ministro della Salute della Federazione Russa, acad. RAMS G.G. Onishchenko 24 giugno 2003

5. Presentato per la prima volta.

1. Introduzione

Produttore: FMS (USA).

Nome commerciale: COMANDO.

Ingrediente attivo: clomazone.

2-(2-clorobenzil)-4,4-dimetil-3-isossalidin-3-one (IUPAC)

Liquido viscoso marrone chiaro.

Punto di fusione: 25 -C.

Punto di ebollizione: 275 -C.

Pressione di vapore a 25 -C: 19,2 MPa.

Coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua: K logP = 2,5.

Altamente solubile in acetone, esano, etanolo, metanolo,

cloroformio, diclorometano e acetonitrile; solubilità in acqua -

1,10 g/cu. dm. Stabile a temperatura ambiente per almeno 2 anni, a 50 -C - almeno 3 mesi.

Profilo tossicologico breve: Orale acuto

tossicità (LD) per ratti - 1369 - 2077 mg/kg; dermico acuto

tossicità (LD) per i ratti - più di 2000 mg/kg; acuto

tossicità per inalazione (LC) per ratti - 4,8 mg / cu. m (4 ore).

Norme igieniche. MPC in acqua - 0,02 mg / cu. dm.

Ambito del farmaco. Il clomazone è un erbicida selettivo utilizzato per controllare i cereali e le erbe infestanti dicotiledoni nelle colture di soia e riso durante l'applicazione di pre-emergenza o pre-semina.

2. Metodo per la determinazione del clomazone in acqua

metodi cromatografici

2.1. Punti chiave

2.1.1. Il principio della tecnica

La tecnica si basa sull'estrazione del clomazone dal campione analizzato con esano, concentrazione dell'estratto e successiva determinazione quantitativa con metodi alternativi:

cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con

rivelatore di raggi ultravioletti, gascromatografia liquida (GLC) con un rivelatore a velocità di ricombinazione costante o cromatografia su strato sottile (TLC). La determinazione quantitativa viene effettuata con il metodo della calibrazione assoluta.

2.1.2. Selettività del metodo

Nelle condizioni proposte, il metodo è specifico in presenza di inquinanti ambientali globali: derivati del cloro delle cicloparaffine (isomeri HCH), composti difenilici (DDT e suoi derivati), loro metaboliti - benzeni e fenoli policlorurati, nonché in presenza di tricloroacetato di sodio, che può essere utilizzato sulle colture come erbicida.

2.1.3. Caratteristica metrologica del metodo (P = 0,95)

Reagenti, soluzioni e materiali

Clomazone con il contenuto del d. 99,8%

(FMS, Stati Uniti)

Azoto, o GOST 9293-79

Ammoniaca d'acqua, 25%, h GOST 1277-81

Acetone, h GOST 2603-79

n-esano, h GOST 2603-79

Perossido di idrogeno, soluzione acquosa al 30% GOST 10929-77

Alcool isopropilico, chimicamente puro TU 6-09-402-75

Acido solforico, GOST 4203-77 chimicamente puro

Acido cloridrico (cloridrico), GOST 3118-77 chimicamente puro

Alcool metilico, GOST chimicamente puro

Sodio idrossido, chimicamente puro, soluzione acquosa al 25% GOST 4323-77

Solfato di sodio anidro, GOST 1277-81 chimicamente puro

Nitrato d'argento, GOST 1277-81 chimicamente puro

2-fenossimetanolo, h TU 6-09-3688-76

Cromatone N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm)

con il 5% SE-30, Hemapol, Repubblica Ceca

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) con 1,5

OV-17 + 1,95% QF-1, Hemapol, Repubblica Ceca

Piastre per HPTLC (URSS)

Registra "Kieselgel 60 F-254" (Germania)

Registra "Silufol" Repubblica Ceca

Filtri in carta "nastro bianco", senza ceneri e prelavati con esano TU 6-09-2678-77

2.3. Posate, attrezzature, utensili

Cromatografo liquido Milchrome

con rivelatore UV

Colonna cromatografica in acciaio,

lunghezza 64 mm, diametro interno 2 mm,

riempito con Silasorb 600, granulometria 5 µm

Gascromatografo serie "Color" o

simile, dotato di un rilevatore costante

tasso di ricombinazione (RPR) con un limite

rilevamento mediante lindano 4 x 10 g/cu. centimetro

Colonna in vetro cromatografico, lunghezza

1 o 2 m, diametro interno 2 - 3 mm

Microsiringa tipo MSH-10, capacità 10 µl TU 5E2-833-024

Apparecchio per agitazione tipo AVU-6s TU 64-1-2851-78

Bagnomaria TU 64-1-2850-76

Tipo di bilancia analitica VLA-200 GOST 34104-80E

Camera cromatografica GOST 10565-74

Pompa a getto d'acqua GOST 10696-75

Irradiatore al quarzo al mercurio tipo OKN-11 TU 64-1-1618-77

Pistole a spruzzo in vetro GOST 10391-74

Evaporatore sottovuoto rotativo IR-1M

o simile TU 25-11-917-76

Gruppo compressore TU 64-1-2985-78

Armadio di asciugatura TU 64-1-1411-76E

Imbuti divisori GOST 3613-75

Matracci tarati, con una capacità di 100 ml GOST 1770-74

Cilindri graduati, con una capacità di 10, 50 ml GOST 1770-74E

Fiasche a forma di pera a sezione sottile,

con una capacità di 100 ml GOST 10394-72

Boccette coniche, con una capacità di 100 ml GOST 22524-77

Provette per centrifuga, misurate GOST 25336-82E

Pipette, con una capacità di 0,1, 1, 2, 5 e 10 ml GOST 20292-74

Imbuti chimici, conici, di diametro

34 - 40 mm GOST 25336-82E

2.4. Selezione del campione

Il campionamento, la conservazione e la preparazione dei campioni vengono effettuati in conformità con

"Norme unificate per il campionamento di prodotti agricoli, prodotti alimentari e oggetti ambientali per la determinazione delle tracce di pesticidi", approvato per N 2051-79 del 21.08.79

I campioni prelevati possono essere conservati in frigorifero per un massimo di 5 giorni. Prima dell'analisi, l'acqua (in presenza di sospensione) viene filtrata attraverso un filtro di carta sfuso.

2.5. Preparazione alla definizione

2.5.1. Metodo HPLC

2.5.1.1. Preparazione della fase mobile per HPLC

In un matraccio tarato della capacità di 100 ml, 5 ml di isopopanolo e 5 ml di metanolo vengono posti con una pipetta, rabboccati con esano, miscelati, filtrati.

2.5.1.2. Condizionamento della colonna

Sciacquare la colonna HPLC con esano-metanolo-isopropanolo (90:5:5, v/v) per 30 min. ad una velocità di alimentazione del solvente di 100 µl/min.

2.5.2. Metodo GLC. Preparazione e condizionamento della colonna

L'imballaggio finito (5% SE-30 su Chromaton N-AW-DMCS) viene versato in una colonna di vetro, compattato sotto vuoto, la colonna viene installata nel termostato cromatografico senza collegamento al rivelatore e stabilizzata in un flusso di azoto ad un temperatura di 250 -C per 10 - 12 mezzogiorno

2.5.3. Metodo TLC

2.5.3.1. Preparazione dei reagenti di sviluppo

2.5.3.1.1. Reagente di sviluppo n. 1

1 g di nitrato d'argento viene sciolto in 1 ml di acqua distillata, vengono aggiunti 10 ml di 2-fenossimetanolo, 190 ml di acetone, 1-2 gocce di perossido di idrogeno, la soluzione viene agitata e trasferita in una bottiglia di vetro scuro.

2.5.3.2.2. Reagente di sviluppo N 2

0,5 g di nitrato d'argento vengono sciolti in 5 ml di acqua distillata in un matraccio tarato da 100 ml, vengono aggiunti 10 ml di ammoniaca acquosa al 25%, la soluzione viene portata a 100 ml con acetone, miscelata e trasferita in una bottiglia di vetro scuro.

2.5.3.2. Preparazione della fase mobile per TLC

In un matraccio tarato della capacità di 100 ml aggiungere 20 ml di acetone e aggiungere esano fino al segno, mescolare. La miscela viene versata nella camera cromatografica con uno strato non superiore a 6 - 8 mm in 30 minuti. Prima di iniziare la cromatografia.

2.5.4. Preparazione di soluzioni standard

Una soluzione standard di clomazone da 100 µ g/mL viene preparata sciogliendo 0,010 g di una preparazione contenente il 99,8% di AI in esano in un matraccio tarato da 100 mL. La soluzione si conserva in frigorifero per un mese.

Soluzioni standard di lavoro con una concentrazione di 0,4; 1.0; 2.0; 4.0; 10.0; 20 e 40,0 µg/ml vengono preparati dalla soluzione standard madre di clomazone mediante diluizioni seriali appropriate con esano.

Le soluzioni di lavoro vengono conservate in frigorifero per non più di un mese.

2.5.5. Costruzione di un grafico di calibrazione

2.5.5.1. Curva di calibrazione A (misurazione secondo paragrafo 2.7.1, HPLC)

Per costruire un grafico di calibrazione, 5 µl di una soluzione standard di lavoro di clomazone con una concentrazione di 4,0 vengono iniettati nell'iniettore del cromatografo; 10.0; 20,0 e 40 µg/ml.

2.5.5.2. Curva di calibrazione B (misurazione secondo paragrafo 2.7.2, GLC)

Per costruire un grafico di calibrazione, 5 µl di una soluzione standard di lavoro di clomazone con una concentrazione di 0,4 vengono iniettati nell'evaporatore del cromatografo; 1.0; 2.0; 4.0 e 10.0.

Eseguire almeno 5 misurazioni parallele. Trova l'altezza media del picco cromatografico per ciascuna concentrazione. Costruire un grafico di calibrazione (A o B) della dipendenza dell'altezza del picco cromatografico in mm dalla concentrazione di clomazone in soluzione in µg/ml.

2.6. Definizione Descrizione

100 ml del campione di acqua analizzato vengono posti in un imbuto separatore della capacità di 250 ml, si aggiungono 10 ml di una soluzione acquosa al 25% di idrossido di sodio, si mescola e si aggiungono 20 ml di n-esano. L'imbuto viene agitato per 3 minuti, dopo separazione di fase, lo strato di esano viene versato in un pallone a forma di pera della capacità di 100 ml, facendolo passare attraverso uno strato di solfato di sodio anidro posto in un imbuto conico su carta da filtro pieghettata. L'estrazione del farmaco dal campione acquoso viene ripetuta altre due volte utilizzando 20 ml di n-esano. L'estratto combinato di esano viene evaporato su un evaporatore rotante sotto vuoto ad una temperatura di 40 -C quasi fino a secchezza, il residuo viene soffiato via con un flusso di aria o azoto di purezza speciale. Il residuo secco viene sciolto in 0,1 (HPLC, TLC) o 0,25 ml (GLC) di n-esano e analizzato mediante uno dei metodi cromatografici.

2.7. Condizioni cromatografiche

Cromatografo liquido con rivelatore di raggi ultravioletti Milichrom (Russia).

Colonna in acciaio lunga 64 mm, diametro interno 2 mm,

riempito con Silasorb 600, granulometria 5 micron.

Temperatura colonna: ambiente.

Fase mobile: esano-isopropanolo-metanolo (90:5:5, v/v).

Portata dell'eluente: 100 µl/min.

Lunghezza d'onda di funzionamento: 240 nm.

Sensibilità: 0,4 unità assorbimento sulla scala.

Volume di iniezione: 5 ml.

Tempo uscita Clomazone: circa 6 min.

Campo di rilevamento lineare: 20 - 200 ng.

I campioni che producono picchi maggiori della soluzione standard da 40 µg/mL vengono diluiti con la fase mobile HPLC.

Gascromatografo "Tsvet-570" con rivelatore di velocità di ricombinazione ionica costante.

Colonna di vetro lunga 1 m, diametro interno 3 mm, riempita con Chromaton N-AW-DMCS con 5% SE-30 (0,16 - 0,20 mm).

La scala di lavoro dell'elettrometro è 64 x 10 10 Ohm.

Velocità del nastro del registratore 200 mm/h.

Temperatura del termostato a colonna - 190 -C

rivelatore - 300 -C

evaporatore - 220 -C

La velocità del gas vettore (azoto) - 60 ml / min.

Il volume del campione iniettato è di 5 µl.

Il tempo di uscita del clomazone è di 2,5 minuti.

Campo di rilevamento lineare: 2 - 50 ng.

I campioni che producono picchi maggiori della soluzione standard da 10 µg/mL vengono diluiti con esano.

Per migliorare l'accuratezza dell'identificazione del clomazone in presenza di gamma-HCCH con un tempo di ritenzione ravvicinato nel campione, il clomazone viene rimosso dal campione mediante trattamento con acido solforico concentrato. La rianalisi del campione consente di stabilire il contributo del clomazone al segnale cromatografico primario.

Soluzione di esano in pallone, ottenuta quantitativamente secondo il paragrafo 2.6

(o una sua aliquota) viene applicato a lastre cromatografiche "Silufol", "Kieselgel 60F-254" o "Plates for HPTLC". Nelle vicinanze, le soluzioni standard vengono applicate in un volume corrispondente al contenuto di clomazone 1, 2, 5 e 10 μg. La piastra viene posta in una camera cromatografica contenente una miscela di n-esano-acetone (4:1, v/v). Dopo lo sviluppo del cromatogramma, la piastra viene rimossa dalla camera, posta sotto tiraggio fino all'evaporazione dei solventi, quindi trattata con uno dei reagenti di sviluppo e posta sotto una lampada a raggi ultravioletti per 5 minuti. La zona di localizzazione del farmaco sulle piastre "Silufol", "Plates for HPTLC" e "Kieselgel 60F-254" appare come macchie grigio-marroni con un valore Rf rispettivamente di 0,35, 0,85 e 0,43. Per determinare il clomazone mediante TLC, è possibile utilizzare le piastre "Alugram" e "Polygram" (prodotte dalla Germania). Il valore Rf del clomazone su queste piastre è rispettivamente di 0,37 e 0,38.

3. Requisiti di sicurezza

È necessario seguire le regole di sicurezza generalmente accettate quando si lavora con solventi organici, sostanze tossiche, riscaldatori elettrici.

4. Controllo degli errori di misurazione

Il controllo operativo dell'errore e della riproducibilità delle misurazioni viene effettuato secondo le raccomandazioni di MI 2335-95. GSI "Controllo interno della qualità dei risultati dell'analisi chimica quantitativa".

5. Sviluppatori

Yudina TV, Fedorova N.E. (FNTSG intitolato a FF Erisman).

Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kiev); Kisenko MA, Demchenko VF (Istituto di Medicina del Lavoro dell'Accademia delle Scienze e dell'Accademia delle Scienze Mediche dell'Ucraina, Kiev).

Cromatografia ad adsorbimento di liquidi su colonna

La separazione di una miscela di sostanze in una colonna di adsorbimento avviene a causa della loro differenza di assorbimento su un dato adsorbente (secondo la legge di sostituzione dell'adsorbimento stabilita da M. S. Tsvet).

Gli adsorbenti sono corpi porosi con una superficie interna molto sviluppata che trattengono i liquidi attraverso fenomeni intermolecolari e superficiali. Questi possono essere composti inorganici e organici polari e non polari. Gli adsorbenti polari includono gel di silice (biossido di silicio gelatinoso essiccato), ossido di alluminio, carbonato di calcio, cellulosa, amido, ecc. Assorbenti non polari: carbone attivo, polvere di gomma e molti altri ottenuti sinteticamente.

Gli adsorbenti sono soggetti ai seguenti requisiti: S non devono entrare in reazioni chimiche con la fase mobile e le sostanze da separare; S deve avere resistenza meccanica; I grani S dell'adsorbente devono avere lo stesso grado di dispersione.

Quando si scelgono le condizioni per il processo cromatografico, vengono prese in considerazione le proprietà delle sostanze adsorbenti e adsorbite.

Nella versione classica della cromatografia su colonna liquida (LCC), un eluente (PF) viene fatto passare attraverso una colonna cromatografica, che è un tubo di vetro di 0,5–5 cm di diametro e lungo 20–100 cm, riempito con un assorbente (NP). L'eluente si muove sotto l'influenza della gravità. La velocità del suo movimento può essere regolata dalla gru nella parte inferiore della colonna. La miscela da analizzare viene posta nella parte superiore della colonna. Mentre il campione si sposta attraverso la colonna, i componenti si separano. A determinati intervalli vengono prelevate frazioni dell'eluente rilasciato dalla colonna, che vengono analizzate con qualsiasi metodo che consenta di misurare le concentrazioni di analiti.

La cromatografia ad adsorbimento su colonna è attualmente utilizzata principalmente non come metodo di analisi indipendente, ma come metodo di separazione preliminare (a volte definitiva) di miscele complesse in miscele più semplici, ad es. per prepararsi all'analisi con altri metodi (compreso quello cromatografico). Ad esempio, una miscela di tocoferoli viene separata su una colonna di allumina, viene fatto passare l'eluente e la frazione α-tocoferolo viene raccolta per la successiva determinazione fotometrica.

La modernizzazione delle apparecchiature utilizzate nella cromatografia su colonna liquida classica ne ha fatto uno dei metodi di analisi moderni e promettenti. La cromatografia liquida ad alte prestazioni è un metodo conveniente per la separazione, l'isolamento preparativo e l'analisi qualitativa e quantitativa di composti non volatili e termolabili a basso e alto peso molecolare.

A seconda del tipo di sorbente utilizzato, questo metodo utilizza 2 opzioni cromatografiche: su un sorbente polare utilizzando un eluente non polare (opzione di fase diretta) e su un sorbente non polare utilizzando un eluente polare - il cosiddetto high a fase inversa -cromatografia liquida ad alte prestazioni (RP HPLC).

Strumentazione per HPLC

Un insieme di moderne apparecchiature per HPLC, di regola, è costituito da due pompe 3,4 (Fig. 7.1.1.1), controllate da un microprocessore 5, e che forniscono eluente secondo un programma specifico. Le pompe creano una pressione fino a 40 MPa. Il campione viene iniettato attraverso un apposito dispositivo (iniettore) 7 direttamente nel flusso dell'eluente. Dopo essere passate attraverso la colonna cromatografica 8, le sostanze vengono rilevate da un rilevatore di flusso 9 ad alta sensibilità, il cui segnale viene registrato ed elaborato dal microcomputer 11. Se necessario, le frazioni vengono selezionate automaticamente al momento del picco di uscita.

Le colonne per HPLC sono realizzate in acciaio inossidabile con un diametro interno di 2 - 6 mm e una lunghezza di 10-25 cm Le colonne sono riempite con un assorbente (NF). Come NF vengono utilizzati gel di silice, allumina o assorbenti modificati. Il gel di silice viene solitamente modificato introducendo chimicamente vari gruppi funzionali sulla sua superficie.

Il segnale continuamente rilevato viene registrato dal registratore. Un cromatogramma è una sequenza di segnali del rivelatore registrati su un registratore a nastro, che vengono generati quando i singoli componenti di una miscela lasciano la colonna. Nel caso di separazione della miscela, sul cromatogramma esterno sono visibili picchi separati. La posizione del picco sul cromatogramma viene utilizzata ai fini dell'identificazione della sostanza, l'altezza o l'area del picco viene utilizzata ai fini della determinazione quantitativa.

Analisi qualitativa

Le caratteristiche più importanti del cromatogramma - il tempo di ritenzione tR e il volume di ritenzione ad esso associato - riflettono la natura delle sostanze, la loro capacità di assorbimento sul materiale della fase stazionaria e, quindi, in condizioni cromatografiche costanti, sono un mezzi per identificare la sostanza. Per una data colonna con una certa portata e temperatura, il tempo di ritenzione di ciascun composto è costante (Fig. 7.1.1.2), dove tR(A) è il tempo di ritenzione del componente A della miscela analizzata dal momento in cui viene iniettato nella colonna fino alla comparsa del picco massimo all'uscita della colonna, 1K(ss) - tempo di ritenzione dello standard interno (sostanza inizialmente assente nella miscela analizzata), h - altezza del picco (mm), ab - larghezza del picco a metà della sua altezza , mm.

Per identificare una sostanza mediante cromatogramma, vengono solitamente utilizzati campioni standard o sostanze pure. Confrontare il tempo di ritenzione del componente IR* sconosciuto con il tempo di ritenzione IRCT delle sostanze note. Ma un'identificazione più affidabile misurando il tempo di ritenzione relativo

In questo caso viene prima introdotta nella colonna una sostanza nota (standard interno) e se ne misura il tempo di ritenzione tR(Bc), quindi la miscela in esame viene separata cromatograficamente (cromatografata), alla quale viene preliminarmente aggiunto lo standard interno. Il tempo di ritenzione relativo è determinato dalla formula (7.1.1.1).

Analisi quantitativa

Questa analisi si basa sulla dipendenza dell'altezza del picco h o della sua area S dalla quantità di sostanza. Per picchi stretti è preferibile la misura h, per picchi ampi sfocati - S. L'area del picco viene misurata in diversi modi: moltiplicando l'altezza del picco (h) per la sua larghezza (ai / 2), misurata a metà della sua altezza (Fig. 7.2.3); pianificazione; utilizzando un integratore. I moderni cromatografi sono dotati di integratori elettrici o elettronici.

Per determinare il contenuto di sostanze in un campione vengono utilizzati principalmente tre metodi: il metodo di calibrazione assoluta, il metodo di normalizzazione interna e il metodo standard interno.

Il metodo di calibrazione assoluta si basa su una determinazione preliminare del rapporto tra la quantità della sostanza introdotta e l'area o altezza del picco sul cromatogramma. Una quantità nota della miscela di calibrazione viene introdotta nel cromatogramma e vengono determinate le aree o le altezze dei picchi risultanti. Costruisci un grafico dell'area o dell'altezza del picco dalla quantità di sostanza iniettata. Il campione di prova viene analizzato, viene misurata l'area o l'altezza del picco del componente da determinare e la sua quantità viene calcolata in base alla curva di calibrazione.

Questo metodo fornisce informazioni solo sul contenuto relativo del componente nella miscela, ma non consente di determinarne il valore assoluto.

Il metodo dello standard interno si basa sul confronto di un parametro di picco selezionato di un analita con lo stesso parametro di una sostanza standard introdotta nel campione in una quantità nota. Una quantità nota di tale sostanza standard viene introdotta nel campione di prova, il cui picco è sufficientemente ben separato dai picchi dei componenti della miscela di prova

Gli ultimi due metodi richiedono l'introduzione di fattori di correzione che caratterizzano la sensibilità dei rivelatori utilizzati alle sostanze analizzate. Per diversi tipi di rivelatori e diverse sostanze, il coefficiente di sensibilità è determinato sperimentalmente.

La cromatografia ad adsorbimento di liquidi utilizza anche l'analisi delle frazioni di soluzioni raccolte nel momento in cui la sostanza esce dalla colonna. L'analisi può essere effettuata con vari metodi fisico-chimici.

La cromatografia ad adsorbimento di liquidi viene utilizzata principalmente per la separazione di sostanze organiche. Questo metodo ha molto successo nello studio della composizione di olio, idrocarburi, separando efficacemente isomeri trans e cis, alcaloidi, ecc. L'HPLC può essere utilizzato per determinare coloranti, acidi organici, amminoacidi, zuccheri, impurità di pesticidi ed erbicidi, sostanze medicinali e altri contaminanti nei prodotti alimentari.

(principalmente intermolecolare) all'interfaccia. Come metodo di analisi, l'HPLC fa parte di un gruppo di metodi che, a causa della complessità degli oggetti in studio, include la separazione preliminare della miscela complessa iniziale in quelli relativamente semplici. Le miscele semplici ottenute vengono poi analizzate con metodi fisico-chimici convenzionali o con metodi speciali sviluppati per la cromatografia.

Il metodo HPLC è ampiamente utilizzato in campi quali la chimica, la petrolchimica, la biologia, la biotecnologia, la medicina, la trasformazione degli alimenti, la protezione dell'ambiente, la produzione di farmaci e molti altri.

Secondo il meccanismo di separazione delle sostanze analizzate o separate, l'HPLC è suddiviso in adsorbimento, distribuzione, scambio ionico, esclusione, scambio di ligandi e altri.

Va tenuto presente che nel lavoro pratico, la separazione spesso procede non per uno, ma per più meccanismi contemporaneamente. Quindi, la separazione per esclusione può essere complicata da effetti di adsorbimento, adsorbimento - distribuzione e viceversa. Allo stesso tempo, maggiore è la differenza di sostanze nel campione in termini di grado di ionizzazione, basicità o acidità, in termini di peso molecolare, polarizzabilità e altri parametri, più è probabile che appaia un diverso meccanismo di separazione per tali sostanze.

HPLC in fase normale

La fase stazionaria è più polare della fase mobile, quindi il solvente non polare predomina nella composizione dell'eluente:

Esano:isopropanolo = 95:5 (per sostanze a bassa polarità)
Cloroformio:metanolo = 95:5 (per sostanze mediamente polari)
Cloroformio:metanolo = 80:20 (per sostanze altamente polari)

HPLC a fase inversa

La fase stazionaria è meno polare della fase mobile, quindi l'acqua è quasi sempre presente nell'eluente. In questo caso, è sempre possibile garantire la completa dissoluzione del BAS nella fase mobile, è quasi sempre possibile utilizzare il rilevamento UV, quasi tutte le fasi mobili sono miscibili tra loro, è possibile utilizzare l'eluizione a gradiente, la colonna può essere rapidamente ri -equilibrato, la colonna può essere rigenerata.

Gli eluenti comuni per HPLC in fase inversa sono:

Acetonitrile: acqua
metanolo: acqua
Isopropanolo: acqua

Matrici per HPLC

Le matrici utilizzate nell'HPLC sono composti inorganici come silice (gel di silice) o allumina, o polimeri organici come il polistirene (reticolato con divinilbenzene) o il polimetacrilato. Il gel di silice è, ovviamente, ora generalmente accettato.

Le principali caratteristiche della matrice:

Dimensione delle particelle (µm);
Dimensione dei pori interni (Å, nm).

Ottenere il gel di silice per HPLC:

Formazione di microsfere di acido polisilicico;
Essiccazione delle particelle di gel di silice;
Separazione dell'aria.

Particelle assorbenti:

Regolare (sferico): maggiore resistenza alla pressione, maggiore costo;
Non sferico: resistenza alla pressione inferiore.

La dimensione dei pori in HPLC è uno dei parametri più importanti. Minore è la dimensione dei pori, peggiore è la loro permeabilità alle molecole delle sostanze eluite. E di conseguenza, peggiore è la capacità di assorbimento dei sorbenti. Più grandi sono i pori, minore è, in primo luogo, la stabilità meccanica delle particelle assorbenti e, in secondo luogo, minore è la superficie di assorbimento, quindi peggiore è l'efficienza.

Innesti di fase stazionaria

HPLC in fase normale:

Fase stazionaria innestata con propilnitrile (nitrile);
Fase stazionaria con innesto di propilammina (ammina).

HPLC a fase inversa:

Fase stazionaria con innesto alchilico;
Fase stazionaria con innesto alchilsililico.

End-capping: protezione delle aree non innestate del sorbente mediante innesto aggiuntivo con molecole "piccole". End-capping idrofobico (C1, C2): maggiore selettività, peggiore bagnabilità; end-capping idrofilo (diolo): minore selettività, maggiore bagnabilità.

Rivelatori HPLC

UV
serie di diodi
Fluorescente
Elettrochimico
Rifrattometrico
selettivo di massa

Collegamenti

Fondazione Wikimedia. 2010.

Scopri cos'è la "cromatografia liquida ad alte prestazioni" in altri dizionari:

cromatografia liquida ad alta prestazione- - [AS Goldberg. Dizionario energetico inglese russo. 2006] Temi energia in generale EN cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC … Manuale tecnico del traduttore

Termine cromatografia liquida ad alte prestazioni Termine inglese cromatografia liquida ad alte prestazioni Sinonimi Abbreviazioni HPLC, HPLC Termini correlati adsorbimento, oligopeptide, proteomica, assorbente, fullerene, endoedrico, cromatografia… …

Cromatografia liquida, al fine di aumentare l'efficienza della separazione, il solvente (eluente) sotto pressione (più di 3x107 Pa) viene pompato attraverso colonne riempite con un assorbente con particelle di piccolo diametro (fino a 1 μm) e la perfusione ... ...

Un tipo di cromatografia in cui il liquido (eluente) funge da fase mobile ed è la fase stazionaria. assorbente, tv. un vettore con un liquido o un gel applicato sulla sua superficie. Eseguito in una colonna riempita con un sorbente (cromatografia a colonna), su un piano ... ... Scienze naturali. dizionario enciclopedico

- [κρώμα (υroma) color] processo basato sulla disuguale capacità dei singoli componenti della miscela (liquida o gassosa) di rimanere sulla superficie dell'adsorbente sia quando vengono assorbiti dal flusso di supporto, sia quando ... ... Enciclopedia geologica

- (da altro greco... Wikipedia

Termine cromatografia Termine inglese cromatografia Sinonimi Abbreviazioni Termini associati cromatografia liquida ad alta prestazione, clatrato, laboratorio su chip, porosimetria, proteoma, proteomica, assorbente, enzima, fullerene, endoedrico… … Dizionario Enciclopedico di Nanotecnologie

Cromatografia liquida basata su decomp. la capacità degli ioni separati di scambio ionico con fisso. ioni assorbenti formati a seguito della dissociazione dei gruppi ionogenici di quest'ultimo. Gli scambiatori cationici sono usati per separare i cationi, per ... ... Enciclopedia chimica

HPLC- cromatografia liquida ad alta prestazione ... Dizionario delle abbreviazioni della lingua russa

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è uno dei metodi efficaci per separare miscele complesse di sostanze, ampiamente utilizzato sia nella chimica analitica che nella tecnologia chimica. La base della separazione cromatografica è la partecipazione... Wikipedia

Libri

Cromatografia liquida pratica ad alte prestazioni, Veronica R. Mayer. Presentiamo al lettore la 5a edizione del libro, che è stata ampliata con metodi e attrezzature moderne. Molto è stato migliorato nel libro ed è stato aggiunto un gran numero di riferimenti. I luoghi nel testo in cui...

9885 0

L'HPLC è una cromatografia su colonna liquida, in cui è possibile utilizzare una varietà di meccanismi di assorbimento. In sostanza, l'HPLC è una forma moderna di cromatografia su colonna liquida classica. Di seguito sono elencate alcune delle caratteristiche qualitative più significative di HPFA:
- elevata velocità del processo, che ha consentito di ridurre la durata della separazione da diverse ore e giorni a pochi minuti;
- il minimo grado di sfocatura delle zone cromatografiche, che consente di separare composti che differiscono solo leggermente per costanti di assorbimento;
- un elevato grado di meccanizzazione e automazione della separazione e dell'elaborazione delle informazioni, grazie al quale la cromatografia liquida su colonna ha raggiunto un nuovo livello di riproducibilità e precisione.

Gli studi intensivi degli ultimi decenni, un'enorme quantità di dati sperimentali accumulati consentono oggi di parlare della classificazione delle varianti nell'ambito del metodo della cromatografia liquida ad alte prestazioni. Naturalmente, in questo caso, resta valida la classificazione secondo il meccanismo di assorbimento sopra indicato.

Una classificazione comune si basa sulla polarità comparativa delle fasi mobile e stazionaria. Si distingue tra cromatografia in fase normale e inversa.

La cromatografia in fase normale (NPC) è una variante dell'HPLC quando la fase mobile è meno polare della fase stazionaria e vi è motivo di ritenere che il principale fattore che determina la ritenzione sia l'interazione dei sorbati direttamente con la superficie o il volume del sorbente .

La cromatografia in fase inversa (RPC) è una variante dell'HPLC quando la fase mobile è più polare di quella stazionaria e la ritenzione è determinata dal contatto diretto delle molecole di sorbato con la superficie o il volume del sorbente; in questo caso i sorbati ionizzati non vengono scambiati con ioni della fase mobile adsorbiti sulla superficie.

Cromatografia a scambio ionico - una variante in cui l'assorbimento viene effettuato scambiando ioni assorbiti della fase mobile con ioni di sostanze cromatografate; la cromatografia a scambio di ligando può essere determinata esattamente nello stesso modo.

La cromatografia su assorbenti dinamicamente modificati è una variante dell'HPLC, in cui il sorbato non interagisce direttamente con la superficie del assorbente, ma entra in associazione con le molecole degli strati superficiali dell'eluente.
La cromatografia a coppia ionica è una variante della cromatografia in fase inversa di composti ionizzati, in cui alla fase mobile viene aggiunto un controione idrofobo, che modifica qualitativamente le caratteristiche di assorbimento del sistema.

La cromatografia ad esclusione dimensionale è un metodo per separare i composti in base al loro peso molecolare, basato sulla differenza nella velocità di diffusione nei pori della fase stazionaria di molecole di varie dimensioni.

Per HPFA, una caratteristica molto importante è la dimensione dei sorbenti, solitamente 3-5 µm, ora fino a 1,8 µm. Ciò consente di separare in modo rapido e completo miscele complesse di sostanze (il tempo medio di analisi va da 3 a 30 min).

Il problema della separazione viene risolto utilizzando una colonna cromatografica, che è un tubo riempito con un assorbente. Durante l'analisi, un liquido (eluente) di una certa composizione viene alimentato attraverso una colonna cromatografica a velocità costante. Una dose di campione accuratamente misurata viene iniettata in questo flusso. I componenti del campione introdotto nella colonna cromatografica, a causa della loro diversa affinità con il sorbente della colonna, si muovono lungo di essa a velocità diverse e raggiungono sequenzialmente il rivelatore in tempi diversi.

Pertanto, la colonna cromatografica è responsabile della selettività e dell'efficienza di separazione dei componenti. Selezionando diversi tipi di colonne è possibile controllare il grado di separazione delle sostanze analizzate. I composti sono identificati dal loro tempo di ritenzione. La determinazione quantitativa di ciascuno dei componenti viene calcolata in base all'ampiezza del segnale analitico misurato utilizzando un rivelatore collegato all'uscita della colonna cromatografica.

assorbenti. La formazione di HPLC è in gran parte associata alla creazione di nuove generazioni di assorbenti con buone proprietà cinetiche e varie proprietà termodinamiche. Il materiale principale per assorbenti in HPLC è il gel di silice. È meccanicamente resistente e presenta una porosità significativa, che offre una grande capacità di scambio per colonne di piccole dimensioni. La dimensione delle particelle più comune è 5-10 micron. Più le particelle sono vicine alla forma sferica, minore è la resistenza al flusso, maggiore è l'efficienza, soprattutto se viene schermata una frazione molto ristretta (ad esempio, 7 +1 micron).

La superficie specifica del gel di silice è di 10-600 m/g. Il gel di silice può essere modificato con vari gruppi chimici innestati sulla superficie (C-18, CN, NH2, SO3H), il che consente di utilizzare assorbenti a base di esso per separare varie classi di composti. Lo svantaggio principale del gel di silice è la sua bassa resistenza chimica a pH< 2 и рН >9 (la silice si dissolve in alcali e acidi). Pertanto, è attualmente in corso un'intensa ricerca di assorbenti a base di polimeri stabili a pH da 1 a 14, ad esempio a base di polimetilmetacrilato, polistirene, ecc.

Sorbenti per cromatografia a scambio ionico. A causa delle peculiarità della separazione (in un mezzo acido o alcalino), il materiale principale è assorbente-polistirene con divinilbenzene di vari gradi di reticolazione con SO3 -H + gruppi innestati sulla loro superficie (scambiatori cationici fortemente acidi) o -COO -Naf (scambiatori di cationi debolmente acidi), -H2N + (CH3) 3Cl- (scambiatori di anioni di basi forti) o -N+HR2Cl- (scambiatori di anioni di basi deboli).

Sorbenti per cromatografia a penetrazione di gel. Il tipo principale è stirene-DVB. Vengono utilizzati anche vetri macroporosi, metacrilato di metile, gel di silice. Per la cromatografia ad esclusione ionica vengono utilizzati gli stessi assorbenti.
Pompe. Per garantire il flusso della fase mobile (MP) attraverso la colonna con i parametri specificati, vengono utilizzate pompe ad alta pressione. Le specifiche più importanti per le pompe LC sono: campo di portata; pressione massima di esercizio; riproducibilità del flusso; gamma di pulsazioni di alimentazione del solvente.

Per la natura dell'alimentazione del solvente, le pompe possono essere di alimentazione (flusso) costante e pressione costante. Fondamentalmente, nel lavoro analitico, viene utilizzata una modalità a flusso costante, durante il riempimento delle colonne viene utilizzata una modalità a pressione costante. Secondo il principio di funzionamento, le pompe sono suddivise in pompe a siringa e pompe alternative a pistoni.

pompe a siringa. Le pompe di questo tipo sono caratterizzate dalla quasi totale assenza di pulsazioni nel flusso della fase mobile durante il funzionamento. Svantaggi della pompa: a) elevato consumo di tempo e solvente per il lavaggio al cambio del solvente; b) sospensione della separazione durante il riempimento della pompa; c) grandi dimensioni e peso pur fornendo un'elevata portata e pressione (è necessario un motore potente e una grande forza del pistone con la sua ampia area).

Pompe alternative a pistoni. Pompe di questo tipo forniscono un flusso volumetrico costante della fase mobile per lungo tempo. Pressione massima di esercizio 300-500 atm, portata 0,01-10 ml/min. Riproducibilità dell'alimentazione volumetrica - 0,5%. Lo svantaggio principale è che il solvente viene immesso nel sistema sotto forma di una serie di impulsi successivi, quindi si verificano pulsazioni di pressione e flusso.

Questo è il motivo principale dell'aumento del rumore e della desensibilizzazione di quasi tutti i rivelatori utilizzati in LC, in particolare elettrochimici. Modi per combattere le pulsazioni: utilizzando pompe doppie o una pompa Bag-lai a due pistoni, utilizzando dispositivi di smorzamento e dispositivi elettronici.

La quantità di alimentazione volumetrica è determinata da tre parametri: diametro dello stantuffo (solitamente 3,13; 5,0; 7,0 mm), la sua ampiezza (12-18 mm) e frequenza (che dipende dalla velocità di rotazione del motore e del cambio).

Dosatori. Lo scopo del dispensatore è trasferire un campione a pressione atmosferica all'ingresso di una colonna a pressioni fino a diverse atmosfere. È importante che il dispensatore sia privo di volumi “morti” che non possono essere lavati via dalla fase mobile e che il campione non si lavi via durante l'erogazione. All'inizio, i distributori in LC erano simili ai distributori di gas con una membrana perforata. Tuttavia le membrane non reggono più di 50-100 atm, la loro resistenza chimica è insufficiente, i loro pezzi contaminano i filtri della colonna e i capillari.

Nella fase liquida, la velocità di diffusione è molto inferiore rispetto alla fase gassosa. Pertanto, è possibile dispensare con un arresto del flusso: il campione non ha il tempo di sfocare nel dispensatore. Durante l'iniezione del campione nel dosatore, un apposito rubinetto interrompe il flusso del solvente. La pressione all'ingresso della colonna diminuisce rapidamente, dopo pochi secondi il campione può essere iniettato nella camera di dosaggio con una microsiringa convenzionale. Successivamente, l'erogatore viene bloccato, il flusso del solvente viene attivato e avviene la separazione.

La pressione che questa valvola mantiene è fino a 500-800 atm. Ma quando il flusso si interrompe, l'equilibrio nella colonna viene disturbato, il che può portare alla comparsa di picchi aggiuntivi "vuoti".

I distributori di loop sono i più utilizzati. Quando si riempie il distributore ad alta pressione, ci sono ingressi 1,2 e un canale tra di loro. Ingressi 3-6, i canali tra loro e il circuito di dosaggio sono a pressione atmosferica, che consente di riempire il circuito con una siringa o una pompa. Quando l'erogatore viene ruotato, il flusso della fase mobile forza il campione nella colonna. Per ridurre l'errore, il ciclo viene lavato con 5-10 volte il volume del campione. Se il campione è piccolo, può essere iniettato nell'ansa con una microsiringa. Il volume del ciclo è generalmente di 5-50 μl.

SUL. Voinov, TG Volova

Cromatografia liquida Questo è un metodo per separare e analizzare miscele complesse di sostanze in cui il liquido è la fase mobile. È applicabile alla separazione di una gamma più ampia di sostanze rispetto al metodo della gascromatografia. Ciò è dovuto al fatto che la maggior parte delle sostanze non sono volatili, molte di esse sono instabili alle alte temperature (soprattutto composti altamente molecolari) e si decompongono quando vengono convertite in uno stato gassoso. La separazione delle sostanze mediante cromatografia liquida viene spesso eseguita a temperatura ambiente.

Le caratteristiche di tutti i tipi di cromatografia liquida sono dovute al fatto che la fase mobile in essa contenuta è un liquido e l'assorbimento dei componenti da un eluente gassoso e liquido procede in modo diverso. Se nella gascromatografia il gas vettore svolge solo una funzione di trasporto e non viene assorbito dalla fase stazionaria, allora la fase mobile liquida nella cromatografia liquida è un eluente attivo, le sue molecole possono essere assorbite dalla fase stazionaria. Passando attraverso la colonna, le molecole dei componenti della miscela analizzata che si trovano nell'eluente devono spostare le molecole dell'eluente dallo strato superficiale del sorbente, il che porta ad una diminuzione dell'energia di interazione tra le molecole del sostanza analizzata e la superficie del sorbente. Pertanto, i valori dei volumi trattenuti V R, proporzionale alla variazione dell'energia libera del sistema, è minore nella cromatografia liquida che nella gascromatografia e l'intervallo di linearità dell'isoterma di assorbimento nella cromatografia liquida è più ampio.

Utilizzando vari eluenti, è possibile modificare i parametri di ritenzione e la selettività del sistema cromatografico. La selettività nella cromatografia liquida, a differenza della gascromatografia, è determinata non da uno, ma da due fattori: la natura delle fasi mobile (eluente) e stazionaria.

La fase mobile liquida ha una densità e una viscosità maggiori rispetto alla fase gassosa, coefficienti di diffusione D bene 3-4 ordini di grandezza inferiori rispetto al gas. Ciò porta a un rallentamento del trasferimento di massa nella cromatografia liquida rispetto alla gascromatografia. L'equazione di Van Deemter dovuta al fatto che il termine V non gioca un ruolo nella cromatografia liquida ( D bene  D G), cambia anche la dipendenza grafica dell'efficienza h sulla velocità lineare del flusso della fase mobile ha la forma mostrata in fig. 1.9.

Nella versione classica della cromatografia liquida su colonna, una colonna di vetro alta 1-2 m, riempita con un assorbente con una dimensione delle particelle di 100 μm ed eluente, viene iniettata con il campione analizzato disciolto nell'eluente e l'eluente viene fatto passare attraverso , prelevando porzioni dell'eluato all'uscita della colonna. Questa versione della cromatografia liquida è ancora utilizzata nella pratica di laboratorio, ma poiché la portata dell'eluente sotto l'azione della gravità è bassa, l'analisi è lunga.

La versione moderna della cromatografia liquida, la cosiddetta cromatografia liquida HPLC ad alte prestazioni, utilizza assorbenti volumetrici e porosi in superficie con una dimensione delle particelle di 5–10 μm, pompe a pressione che forniscono pressione nel sistema fino a 400 atm e rivelatori sensibili. Il rapido trasferimento di massa e l'elevata efficienza di separazione consentono di utilizzare l'HPLC per la separazione di molecole (cromatografia ad assorbimento di liquido e di partizione liquido-liquido), per la separazione di ioni (cromatografia a scambio ionico, ionica, a coppia ionica), per la separazione delle macromolecole (cromatografia ad esclusione dimensionale).

1.3. RITENZIONE E FORZA DEL SOLVENTE

Affinché gli analiti possano essere separati sulla colonna, come detto sopra, il fattore di capacità k" deve essere maggiore di 0, cioè le sostanze devono essere trattenute dalla fase stazionaria, il sorbente. Tuttavia, il fattore di capacità non deve essere troppo grande per ottenere un tempo di eluizione accettabile Se si sceglie una fase stazionaria per una data miscela di sostanze che le contiene, il lavoro ulteriore sullo sviluppo di una procedura di analisi consiste nella scelta di un solvente che fornisca, nel caso ideale, per tutti i componenti, ma accettabile non molto grande k. Ciò si ottiene modificando la forza di eluizione del solvente.

Nel caso della cromatografia ad adsorbimento su gel di silice o allumina, di norma, la forza di un solvente bicomponente (ad esempio esano con aggiunta di isopropanolo) viene aumentata aumentando il contenuto del componente polare (isopropanolo) in esso , o ridotto diminuendo il contenuto di isopropanolo. Se il contenuto del componente polare diventa troppo basso (inferiore allo 0,1%), dovrebbe essere sostituito con un potere di eluizione più debole. Lo stesso avviene, sostituendo la componente polare o non polare con altre, anche se questo sistema non fornisce la selettività desiderata rispetto alle componenti della miscela di interesse. Quando si selezionano i sistemi di solventi, vengono prese in considerazione sia le solubilità dei componenti della miscela che le serie eluotropiche di solventi compilate da autori diversi.

Approssimativamente allo stesso modo, la forza del solvente viene selezionata nel caso di utilizzo di fasi polari innestate (nitrile, amino, diolo, nitro, ecc.), tenendo conto di possibili reazioni chimiche ed escludendo solventi pericolosi per la fase (ad esempio , aldeidi e chetoni per la fase amminica).

Nel caso della cromatografia in fase inversa, la forza del solvente viene aumentata aumentando il contenuto della componente organica (metanolo, acetonitrile o THF) nell'eluente e ridotta aggiungendo più acqua. Se non è possibile ottenere la selettività desiderata, si utilizza un altro componente organico o si tenta di cambiarlo con l'aiuto di vari additivi (acidi, reagenti a coppie di ioni, ecc.).

Nelle separazioni mediante cromatografia a scambio ionico, la forza del solvente viene modificata aumentando o diminuendo la concentrazione della soluzione tampone o modificando il pH, in alcuni casi viene utilizzata la modifica con sostanze organiche.

Tuttavia, soprattutto nel caso di miscele naturali e biologiche complesse, spesso non è possibile scegliere la forza del solvente in modo tale che tutti i componenti del campione vengano eluiti in un tempo accettabile. Quindi si deve ricorrere all'eluizione a gradiente, cioè utilizzare un solvente la cui forza di eluizione durante l'analisi cambia in modo da aumentare costantemente secondo un programma predeterminato. Con questa tecnica è possibile ottenere l'eluizione di tutti i componenti di miscele complesse in un periodo di tempo relativamente breve e la loro separazione in componenti sotto forma di picchi stretti.

1.6.1. Cromatografia liquida ad adsorbimento. La cromatografia liquida ad adsorbimento, a seconda della polarità delle fasi stazionaria e mobile, è suddivisa in cromatografia in fase normale (NPC) e in fase inversa (RPC). In NPC si utilizzano un adsorbente polare e fasi mobili non polari; in OFC si utilizzano un adsorbente non polare e fasi mobili polari, ma in entrambi i casi la scelta della fase mobile è spesso più importante della scelta della fase mobile quello stazionario. La fase stazionaria deve contenere le sostanze da separare. La fase mobile, ovvero il solvente, deve fornire diverse capacità della colonna e separazioni efficienti in un tempo ragionevole.

Come fase stazionaria nella cromatografia liquida ad adsorbimento, vengono utilizzati materiali porosi finemente dispersi polari e non polari con un'area superficiale specifica superiore a 50 m 2 /g. Gli adsorbenti polari (SiO 2 ,Al 2 O 3 , florisil, ecc.) presentano in superficie gruppi debolmente acidi, in grado di trattenere sostanze con proprietà basiche. Questi adsorbenti sono utilizzati principalmente per la separazione di composti non polari e medi polari. Il loro svantaggio è l'elevata sensibilità al contenuto di acqua negli eluenti utilizzati. Per eliminare questo inconveniente, i assorbenti polari vengono trattati con ammine, dioli e altri reagenti, con conseguente innesto superficiale di questi reagenti, modificazione della superficie e cambiamento nella selettività rispetto agli analiti.

Gli adsorbenti non polari (fuliggine grafitizzata, diatomite, farina fossile) non sono selettivi rispetto alle molecole polari. Per ottenere adsorbenti non polari, i gruppi non polari vengono spesso innestati sulla superficie, ad esempio del gel di silice, ad esempio alchilsilil - SiR 3, dove i gruppi R - alchilici sono C 2 - C 22.

La fase mobile dovrebbe dissolvere completamente il campione analizzato, avere una bassa viscosità (in modo che i coefficienti di diffusione siano sufficientemente grandi), è auspicabile che sia possibile separare i componenti separati da esso. Deve essere inerte ai materiali di tutte le parti del cromatografo, sicuro, economico, adatto al rivelatore.

Le fasi mobili utilizzate nella cromatografia liquida differiscono per la loro forza di eluizione. Il potere di eluizione del solvente mostra quante volte l'energia di assorbimento di un dato eluente su un dato adsorbente è maggiore dell'energia di assorbimento dell'eluente scelto come standard, ad esempio n-eptano. I solventi deboli sono scarsamente adsorbiti dalla fase stazionaria, quindi i coefficienti di distribuzione delle sostanze assorbite (sorbato) sono elevati. Al contrario, i solventi forti si adsorbono bene, quindi i coefficienti di partizione del sorbato sono bassi. Più forte è il solvente, maggiore è la solubilità del campione analizzato in esso, più forte è l'interazione solvente-sorbato.

Per garantire un'elevata efficienza di separazione sulla colonna, è necessario scegliere una fase mobile che abbia la polarità ottimale per la miscela da separare nelle condizioni di separazione selezionate. Tipicamente, viene selezionata per prima la fase stazionaria, che ha una polarità prossima a quella dei componenti da separare. Quindi viene selezionata la fase mobile, assicurando che il coefficiente di capacità K" si è rivelato essere compreso tra 2 e 5. Se la polarità della fase mobile è troppo vicina alla polarità della fase stazionaria, il tempo di ritenzione dei componenti sarà troppo breve e se le polarità della fase mobile e stazionaria le fasi differiscono molto, il tempo di ritenzione diventa troppo lungo.

Nella scelta delle fasi mobili, sono guidate dalle cosiddette serie eluotropiche, basate sull'uso di indici di polarità Snider R", che suddivide tutti i solventi in forti (polari) e deboli (debolmente polari e non polari). La scala di polarità si basa sulla solubilità delle sostanze utilizzate come fasi mobili in diossano, nitrometano ed etanolo.

La tabella 1.2 mostra i valori dell'indice di polarità e della forza di eluizione (rispetto a SiO 2 ) di alcuni solventi più comunemente usati in cromatografia liquida come fasi mobili. Qui sono indicati anche i limiti di trasparenza della lunghezza d'onda corta di questi solventi, il che facilita la selezione delle condizioni per il rilevamento dei componenti della miscela.

Tabella 1.2

Caratteristiche dei solventi utilizzati nella cromatografia liquida

Solvente	Indice di polarità	Potere di eluizione (SiO 2)	Limite di trasparenza delle onde corte
Fluoralcano
Cicloesano
n-Esano
Tetracloruro di carbonio
Etere diisopropilico

etere dietilico
diclorometano
tetraidrofurano
Cloroformio

Acido acetico


Acetonitrile
nitrometano

La cromatografia liquida spesso non utilizza singoli solventi, ma le loro miscele. Spesso, aggiunte minori di un altro solvente, in particolare acqua, aumentano notevolmente la forza di eluizione dell'eluente.

Quando si separano miscele multicomponente, una fase mobile come eluente potrebbe non separare tutti i componenti del campione in un tempo ragionevole. In questo caso, viene utilizzato un metodo di eluizione graduale o graduale, in cui vengono utilizzati eluenti sempre più forti in sequenza durante la cromatografia, il che consente di eluire sostanze altamente trattenute in meno tempo.

Nella cromatografia liquida, ce ne sono alcuni empirico regole molto utili nella scelta di un eluente:

 l'assorbimento di un composto, di regola, aumenta all'aumentare del numero di doppi legami e gruppi OH in esso contenuti;

 l'assorbimento diminuisce in un certo numero di composti organici: acidialcolialdeidichetoniesteriidrocarburi insaturiidrocarburi saturi;

 per separare sostanze di diversa polarità e separare sostanze di diverse classi, si utilizza la cromatografia in fase normale: il campione analizzato viene sciolto ed eluito con un eluente non polare, i composti di diverse classi lasciano la colonna con un adsorbente polare per tempi diversi, mentre il tempo di ritenzione di composti con diversi gruppi funzionali aumenta durante il passaggio da composti non polari a composti debolmente polari. Per molecole molto polari, i tempi di ritenzione sono così lunghi che l'analisi non è possibile quando si utilizza un eluente non polare. Per ridurre il tempo di ritenzione dei componenti polari si passa agli eluenti polari;

 nella variante a fase inversa, la fase stazionaria (adsorbente non polare) assorbe più fortemente la componente non polare dagli eluenti polari, ad esempio dall'acqua;

 Riducendo la polarità dell'eluente con l'aggiunta di un solvente meno polare, è possibile ridurre la ritenzione dei componenti.

1.6.2. Cromatografia liquida di partizione. Nella cromatografia di partizione o liquido-liquido, la separazione dei componenti del campione analizzato è dovuta a differenze nei coefficienti della loro distribuzione tra due fasi liquide che non si mescolano tra loro, di cui una stazionaria e si trova in superficie o nei pori di un solido supporto immobile, e il secondo è mobile.

Per la natura delle forze di interazione che determinano una diversa distribuzione tra le due fasi di sostanze che differiscono nella loro struttura chimica, la cromatografia di distribuzione è simile alla cromatografia di adsorbimento, cioè qui la separazione si basa anche sulla differenza delle forze di interazione intermolecolare tra i componenti del campione analizzato con le fasi liquide stazionarie e mobili.

A seconda della tecnica di prestazione, la cromatografia di partizione, come la cromatografia ad adsorbimento, può essere a colonna o planare (carta o strato sottile).

Come veicoli solidi vengono utilizzate sostanze indifferenti al solvente mobile e ai componenti del campione analizzato, ma capaci di trattenere la fase stazionaria in superficie e nei pori. Molto spesso, le sostanze polari (cellulosa, gel di silice, amido) vengono utilizzate come vettori. Vengono applicati alla fase stazionaria: un solvente polare, il più delle volte acqua o alcol. In questo caso vengono utilizzate come fasi mobili sostanze meno polari o non polari (alcoli, ammine, chetoni, idrocarburi, ecc.). Questo tipo di cromatografia di partizione è chiamato fase normale. È usato per separare le sostanze polari.

La seconda variante della cromatografia di partizione differisce in quanto i veicoli non polari (gomma, PTFE, gel di silice idrofobizzato) sono usati come fase solida stazionaria, solventi non polari (idrocarburi) come fase liquida stazionaria e solventi polari (alcoli, aldeidi ) come fase liquida mobile. , chetoni, ecc., spesso acqua). Viene chiamata questa variante della cromatografia di partizione fase inversa ed è usato per separare sostanze non polari.

Per ottenere una separazione ottimale dei componenti del campione analizzato, la selezione della fase mobile è molto importante. I solventi (fasi liquide mobili e stazionarie) devono essere selezionati in modo che i coefficienti di distribuzione dei componenti della miscela differiscano in modo significativo. Le fasi liquide sono soggette a quanto segue requisiti:

1) i solventi utilizzati devono sciogliere bene le sostanze da separare, e la loro solubilità nella fase stazionaria deve essere maggiore che in quella mobile;

2) i solventi utilizzati come fase mobile e stazionaria devono essere mutuamente saturati, ovvero la composizione del solvente deve essere costante durante il passaggio attraverso la colonna;

3) l'interazione dei solventi utilizzati come fase mobile con la fase stazionaria dovrebbe essere minima.

Molto spesso, nella cromatografia liquida a partizione, non vengono utilizzate singole sostanze come fasi liquide mobili, ma le loro miscele in vari rapporti. Ciò consente di regolare la polarità della fase mobile, modificare il rapporto tra le polarità delle fasi mobile e stazionaria e ottenere condizioni ottimali per separare i componenti di una particolare miscela in analisi.

Uno svantaggio significativo di questo metodo cromatografico è il lavaggio piuttosto rapido della fase liquida stazionaria depositata dal supporto. Per eliminarlo, il solvente utilizzato come fase mobile viene saturato con la sostanza utilizzata come fase liquida stazionaria, oppure la fase liquida stazionaria viene stabilizzata mediante innesto su un supporto.

Una variazione della cromatografia liquida a partizione è il metodo HPLC ampiamente utilizzato.

I sistemi cromatografici più comuni sono sistemi che hanno un principio di assemblaggio modulare. Pompe, degasatori, rivelatori, erogatori (autocampionatori), forni a colonna, collettori di frazioni, controlli del sistema di cromatografia e registratori sono disponibili come moduli separati. Un'ampia gamma di moduli consente di risolvere in modo flessibile vari problemi analitici, modificare rapidamente la configurazione del sistema se necessario, con costi minimi. Allo stesso tempo vengono prodotti anche LC monomodulari (integrati), il cui principale vantaggio è la miniaturizzazione dei singoli blocchi e la compattezza del dispositivo.

A seconda del metodo di eluizione, i cromatografi liquidi sono divisi in isocratici e gradienti.

Schema di un cromatografo isocratico

La fase mobile dal serbatoio (1) attraverso il filtro di ingresso (9) viene fornita da una pompa di precisione ad alta pressione (2) al sistema di ingresso del campione (3) - un iniettore manuale o un autocampionatore, dove viene anche iniettato il campione . Inoltre, attraverso il filtro in linea (8), il campione con la corrente della fase mobile entra nell'elemento di separazione (elementi) (4) - attraverso la precolonna nella colonna di separazione. Quindi, l'eluato entra nel rivelatore (5) e viene rimosso nel serbatoio di scarico (7). Quando l'eluato scorre attraverso il circuito di misura del rivelatore, il cromatogramma viene registrato ei dati vengono trasmessi ad un registratore analogico (registratore) (6) o ad un altro sistema per la raccolta e l'elaborazione dei dati cromatografici (integratore o computer). A seconda del design dei moduli funzionali, il sistema può essere controllato dalla tastiera del modulo di controllo (solitamente una pompa o un controller di sistema), dalle tastiere di ciascuno dei moduli di sistema o da un programma di controllo da un personal computer.

Nel caso dell'eluizione in gradiente, vengono utilizzati due tipi fondamentalmente diversi di cromatografi liquidi. Differiscono nel punto di formazione del gradiente di composizione della fase mobile.

Schema di un cromatografo a gradiente con formazione di un gradiente della composizione della fase mobile sulla linea di bassa pressione.

La fase mobile dai serbatoi (1) attraverso i filtri di ingresso (9) e il programmatore del gradiente (10) è fornita da una pompa di precisione ad alta pressione (2) al sistema di iniezione del campione (3) - un iniettore manuale o un autocampionatore , dove viene anche iniettato il campione. Il funzionamento delle valvole programmatrici di gradiente è controllato dal modulo di controllo del sistema (pompa o controller) o da un programma di controllo per PC. Sistemi di questo tipo formano un gradiente binario, tridimensionale e quadridimensionale. La forma della funzione di elaborazione del gradiente dipende dal modulo di controllo o dal programma di controllo specifico, nonché dalla funzionalità dei moduli di controllo e di controllo. Inoltre, attraverso il filtro in linea (8), il campione con la corrente della fase mobile entra nell'elemento di separazione (elementi) (4) - attraverso la precolonna nella colonna di separazione. Quindi, l'eluato entra nel rivelatore (5) e viene rimosso nel serbatoio di scarico (7). Quando l'eluato scorre attraverso il circuito di misura del rivelatore, il cromatogramma viene registrato ei dati vengono trasmessi ad un registratore analogico (registratore) (6) o ad un altro sistema per la raccolta e l'elaborazione dei dati cromatografici (integratore o computer). A seconda del design dei moduli funzionali, il sistema può essere controllato dalla tastiera del modulo di controllo (solitamente una pompa o un controller di sistema) o da un programma di controllo da un personal computer. Nel caso di controllo del modulo di controllo, è possibile comandare indipendentemente il rivelatore dalla propria tastiera.

Nonostante l'apparente attrattiva di tali sistemi (utilizzano una sola pompa di precisione ad alta pressione), questi sistemi presentano una serie di svantaggi, tra i quali il principale, forse, è la forte necessità di un accurato degasaggio dei componenti della fase mobile anche prima della miscelatore a bassa pressione (camera del programmatore a gradiente). Viene eseguito con l'ausilio di speciali degasatori a flusso. Per questo motivo, il loro costo diventa paragonabile a un altro tipo di sistemi a gradiente - sistemi con la formazione di una composizione a gradiente della fase mobile sulla linea ad alta pressione.

La differenza fondamentale tra i sistemi con la formazione di una composizione a gradiente di fase mobile nella linea ad alta pressione è la miscelazione dei componenti nella linea ad alta pressione, naturalmente, con questo approccio, il numero di pompe di precisione è determinato dal numero di serbatoi per la miscelazione la fase mobile. Con questo approccio, i requisiti per la completezza del degasaggio dei componenti sono notevolmente ridotti.

Schema di un cromatografo a gradiente con formazione di un gradiente della composizione della fase mobile sulla linea di alta pressione.

La fase mobile dai serbatoi (1) attraverso i filtri di ingresso (9) è fornita da pompe ad alta pressione di precisione (2 e 11) attraverso un miscelatore di flusso statico o dinamico (10) al sistema di iniezione del campione (3) - un manuale iniettore o un autocampionatore, in cui viene anche iniettato il campione. Il funzionamento delle pompe controllate è controllato dal modulo di controllo del sistema (pompa principale o controller) o da un programma di controllo per PC. In questo caso, tutte le pompe sono controllate. Sistemi di questo tipo formano un gradiente binario o tridimensionale. La forma della funzione di elaborazione del gradiente dipende dal modulo di controllo o dal programma di controllo specifico, nonché dalla funzionalità dei moduli di controllo e di controllo. Inoltre, attraverso il filtro in linea (8), il campione con la corrente della fase mobile entra nell'elemento di separazione (elementi) (4) - attraverso la precolonna nella colonna di separazione. Quindi l'eluato entra nel rivelatore (5) e viene rimosso nel serbatoio di scarico (7). Quando l'eluato scorre attraverso il circuito di misura del rivelatore, il cromatogramma viene registrato ei dati vengono trasmessi ad un registratore analogico (registratore) (6) o ad un altro sistema per la raccolta e l'elaborazione dei dati cromatografici (integratore o computer). A seconda del design dei moduli funzionali, il sistema può essere controllato dalla tastiera del modulo di controllo (solitamente una pompa o un controller di sistema) o da un programma di controllo da un personal computer. Nel caso di controllo del modulo di controllo, è possibile comandare indipendentemente il rivelatore dalla propria tastiera.

Gli schemi proposti sono piuttosto semplificati. Dispositivi aggiuntivi possono essere inclusi nei sistemi: un termostato a colonna, sistemi di derivatizzazione post-colonna, sistemi di preparazione e concentrazione dei campioni, un riciclatore di solventi, sistemi a membrana per sopprimere la conduttività elettrica di fondo (per cromatografia ionica), sistemi di protezione aggiuntivi (filtri, colonne) , eccetera. Nei diagrammi, anche i moduli manometrici non sono mostrati separatamente. Di norma, questi dispositivi sono integrati nelle unità pompa. Queste unità possono combinare più pompe, una pompa con un programmatore di gradiente e un controller di sistema comune. La struttura del sistema dipende dalla sua configurazione e da ogni specifico produttore.

Una complicazione così radicale del supporto tecnico del processo cromatografico porta all'emergere di una serie di requisiti per le proprietà della fase mobile, che sono assenti nella colonna classica e nella cromatografia planare. La fase liquida deve essere idonea alla rivelazione (essere trasparente in una determinata regione dello spettro o avere un basso indice di rifrazione, una certa conducibilità elettrica o permittività, ecc.), inerte ai materiali delle parti del tratto cromatografico, non forma bolle di gas nelle valvole della pompa e nella cella del rivelatore, non presentano impurità meccaniche.

In cromatografia liquida vengono utilizzati molti tipi di pompe. L'LC a bassa pressione utilizza spesso pompe peristaltiche (Figura 1).

Fig.1 Pompa peristaltica programmabile MasterFlex.

In HPLC, le pompe ad alta pressione vengono utilizzate per garantire il flusso della fase mobile attraverso la colonna con i parametri specificati.

Le caratteristiche tecniche più importanti delle pompe HPLC sono: campo di portata; pressione massima di esercizio; riproducibilità del flusso; gamma di pulsazioni di alimentazione del solvente.

Secondo il principio di funzionamento, le pompe HPLC sono suddivise in siringa e via stantuffo ricambiare .

Pompe a siringa

La principale caratteristica distintiva di queste pompe è il loro funzionamento ciclico, quindi i cromatografi in cui queste pompe vengono utilizzate differiscono anche per il funzionamento ciclico.

Riso. 2. Disposizione principale di una pompa a siringa per HPLC.

Riso. 2A. Pompa a siringa.

L'unità di controllo BU fornisce tensione al motore D, che ne determina la velocità e il senso di rotazione. La rotazione del motore con l'aiuto del cambio P viene convertita nel movimento del pistone P all'interno del cilindro D. La pompa viene azionata in 2 cicli. Nel ciclo di riempimento, la valvola K2 è chiusa, K1 è aperta, il solvente scorre dal serbatoio al cilindro C. Nella modalità di alimentazione, la valvola K1 è chiusa e attraverso la valvola K2 la fase mobile entra nel dispositivo di dosaggio.

Le pompe di questo tipo sono caratterizzate dalla quasi totale assenza di pulsazioni nel flusso della fase mobile durante il funzionamento.

Svantaggi della pompa:

a) elevato consumo di tempo e solvente per il lavaggio al cambio del solvente;

b) il volume di PF limitato dal volume della siringa, e quindi il tempo limitato di separazione;

c) sospensione della separazione durante il riempimento della pompa;

d) grandi dimensioni e peso pur fornendo un'elevata portata e pressione (è necessario un motore potente e una grande forza del pistone con la sua ampia area).

Pompe alternative a pistoni.

Riso. 3. Dispositivo principale di una pompa a pistoni.

Principio operativo.

Il motore D attraverso il cambio R ricambia lo stantuffo P, spostandosi nella testa di lavoro della pompa. Le valvole K1 e K2 si aprono quando la pompa è rispettivamente in aspirazione e in mandata. La quantità di alimentazione volumetrica è determinata da tre parametri: diametro dello stantuffo (solitamente 3,13; 5,0; 7,0 mm), la sua ampiezza (12-18 mm) e frequenza (che dipende dalla velocità di rotazione del motore e del cambio).

Pompe di questo tipo forniscono un flusso volumetrico costante della fase mobile per lungo tempo. Pressione massima di esercizio 300-500 atm, portata 0,01-10 ml/min. Ripetibilità dell'avanzamento in volume -0,5%. Lo svantaggio principale è che il solvente viene immesso nel sistema sotto forma di una serie di impulsi successivi, quindi si verificano pulsazioni di pressione e flusso (Fig. 4). Questo è il motivo principale dell'aumento del rumore e della desensibilizzazione di quasi tutti i rivelatori utilizzati in LC, in particolare elettrochimici.

Fig.4. Pulsazione della pompa a pistoni.

Modi per affrontare le pulsazioni.

1. Applicazione di dispositivi di smorzamento.

Si tratta di tubi a spirale di speciale profilo in acciaio inox, inseriti in serie o in parallelo nel sistema tra la pompa e l'erogatore.

Riso. 5. Ammortizzatore a spirale.

L'ammortizzatore non è attorcigliato con un aumento della pressione al suo interno (accelerazione della pompa). Quando la pressione scende, si attorciglia, il suo volume diminuisce, spreme parte del solvente, mantenendo una portata costante e riducendo le pulsazioni. Un tale ammortizzatore funziona bene a una pressione di 50 atm e oltre.

A una pressione di 5-30 atm, attenua meglio le pulsazioni serranda dell'aria, costituito da una colonna (Fig. 6.). L'aria nella colonna tappata (6x200 mm) viene compressa e le pulsazioni vengono estinte. L'aria al suo interno si dissolve in 24 ore.

Riso. 6. Serranda dell'aria.

2. L'uso di dispositivi elettronici.

Quando si utilizza un trasduttore di pressione elettronico, le letture del trasduttore possono essere utilizzate per controllare il funzionamento della pompa. Quando la pressione diminuisce, il regime del motore aumenta e compensa la diminuzione della pressione. È anche possibile compensare perdite nelle valvole e parzialmente nei polsini. L'uso di uno smorzatore elettronico (BPZh-80, KhPZh-1, ecc.) consente di ridurre le pulsazioni di pressione a 1 atm ad una pressione di 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Cromatografia a scambio ionico, ionica, a coppie di ioni. I metodi di cromatografia a scambio ionico, ionico e a coppia di ioni si basano sul processo dinamico di sostituzione degli ioni associati alla fase stazionaria con ioni eluente che entrano nella colonna. L'obiettivo principale del processo cromatografico è la separazione di ioni inorganici o organici dello stesso segno. La ritenzione in questi tipi di cromatografia è determinata dalla variazione dell'energia libera della reazione di scambio ionico. Il rapporto tra le concentrazioni di ioni scambiatori nella soluzione e nella fase assorbente è caratterizzato dall'equilibrio di scambio ionico. Lo scambio ionico consiste nel fatto che alcune sostanze (scambiatori di ioni), quando immerse in una soluzione elettrolitica, assorbono da essa cationi o anioni, rilasciando nella soluzione una quantità equivalente di altri ioni con carica dello stesso segno. Tra lo scambiatore di cationi e la soluzione c'è uno scambio di cationi, tra lo scambiatore di anioni e la soluzione c'è uno scambio di anioni.

Gli scambiatori cationici sono spesso sostanze polimeriche insolubili appositamente sintetizzate contenenti gruppi ionogenici acidi nella loro struttura: -SO 3 H; –COOH; -OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

Le formule chimiche degli scambiatori cationici possono essere rappresentate schematicamente come R-SO 3 H; R-SO 3 Na. Nel primo caso lo scambiatore cationico è in forma H, nel secondo in forma Na. R è una matrice polimerica.

Le reazioni di scambio cationico sono scritte come normali reazioni chimiche eterogenee:

RN+Na+RNa+H+

Gli scambiatori di anioni contengono nella loro struttura gruppi ionogenici di base: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + ecc. Le loro formule chimiche possono essere rappresentate come RNH 3 OH e RNH 3 Cl o ROH, RCl. Nel primo caso lo scambiatore anionico è in forma OH, nel secondo in forma Cl. La reazione di scambio anionico può essere scritta come segue:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Sono noti scambiatori di ioni anfoteri che contengono nella loro struttura gruppi sia acidi che basici. Gli scambiatori di ioni che hanno nella loro composizione lo stesso tipo (ad esempio, SO 3 H) gruppi acidi (basici) sono detti monofunzionali; scambiatori di ioni contenenti gruppi acidi (basici) eterogenei (ad esempio - SO 3 H, - OH) - polifunzionali.

Gli scambiatori di ioni monofunzionali sono ottenuti mediante una reazione di polimerizzazione. La reazione di policondensazione permette di ottenere scambiatori ionici polifunzionali. Affinché gli scambiatori ionici risultanti abbiano caratteristiche prestazionali sufficientemente elevate, devono essere insolubili, ma rigonfiabili nell'apposito solvente e avere un numero sufficientemente elevato di gruppi ionogenici in grado di scambiarsi con i gruppi ionogenici del campione analizzato. Ciò può essere ottenuto se le catene polimeriche risultanti sono sufficientemente ramificate e collegate tra loro da "ponti di reticolazione". Ad esempio, nella preparazione di scambiatori cationici del tipo a polimerizzazione a base di stirene, il divinilbenzene viene spesso utilizzato come agente reticolante, la cui introduzione in una quantità fino al 16% garantisce la produzione di scambiatori di ioni con vari gradi di rigonfiamento e, consente quindi di controllare la porosità dello scambiatore di ioni. Il grado di rigonfiamento dello scambiatore ionico, espresso in millilitri/grammo, è il volume di 1 g di scambiatore ionico aria-secco confezionato nella colonna.

Lo scambiatore di ioni assorbe, di regola, uno dei controioni - ioni nella fase mobile, ovvero mostra una certa selettività. Sono state stabilite sperimentalmente serie di affinità, o selettività, di ioni rispetto a scambiatori ionici di vario tipo. Ad esempio, a basse concentrazioni di soluzione su scambiatori di cationi fortemente acidi, gli ioni con la stessa carica vengono assorbiti nella seguente sequenza:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Per ioni con cariche diverse, la sorbibilità aumenta all'aumentare della carica:

Na+Ca2+

Tuttavia, la modifica delle condizioni per l'esecuzione della reazione di scambio ionico può portare all'inversione di serie. Sono state stabilite anche serie di affinità per scambiatori di anioni. Ad esempio, la sorbibilità degli anioni su scambiatori di anioni fortemente basici aumenta nella serie:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 - .

Gli scambiatori di ioni contenenti gruppi fortemente acidi o fortemente basici nella loro struttura entrano in reazioni di scambio ionico con qualsiasi ione in soluzione che abbia cariche dello stesso segno del segno del controione. Tali scambiatori di ioni sono chiamati universali.

Il processo di scambio ionico tra l'analita e lo scambiatore ionico può essere effettuato in tre modi: statico, dinamico (metodo del filtro a scambio ionico) e cromatografico.

Metodo statico lo scambio ionico è che un campione dello scambiatore ionico viene messo in contatto con un certo volume di soluzione e agitato o agitato per un certo tempo fino a quando non si stabilisce l'equilibrio. Questo è un metodo di scambio ionico rapido e semplice, utilizzato per concentrare gli ioni dalle soluzioni diluite, rimuovere le impurità indesiderate, ma non fornisce un assorbimento completo degli ioni, poiché lo scambio ionico è un processo di non equilibrio e quindi non garantisce la separazione completa di ioni.

Quando si esegue lo scambio ionico in modo dinamico una soluzione viene fatta passare attraverso la colonna con uno scambiatore di ioni che, muovendosi lungo la colonna, viene a contatto con nuovi granuli dello scambiatore di ioni. Questo processo fornisce uno scambio più completo rispetto al metodo statico, poiché i prodotti di scambio vengono rimossi dal flusso della soluzione. Possono concentrare ioni da soluzioni diluite e ioni separati che differiscono notevolmente nelle proprietà, ad esempio ioni con carica diversa (cationi separati dagli anioni), ma la separazione di ioni con lo stesso segno di carica è quasi impossibile. La separazione quantitativa di tali ioni è possibile solo con ripetute ripetizioni di atti elementari di assorbimento-desorbimento in condizioni dinamiche, ad es. metodo cromatografico . Quando si lavora con questo metodo, vengono utilizzati alti strati di scambiatore di ioni e la miscela da separare viene introdotta in questo strato in una quantità molto inferiore alla capacità della colonna, grazie alla quale è assicurata la ripetizione ripetuta di atti elementari di scambio ionico .

In termini di tecnica di analisi, la cromatografia a scambio ionico è simile alla cromatografia molecolare e può essere eseguita in base alle opzioni dell'eluente (in via di sviluppo), frontale e di spostamento. La differenza tra cromatografia molecolare e cromatografia a scambio ionico è che nella cromatografia molecolare i componenti separati della miscela vengono eluiti dalla colonna con un eluente puro, mentre nella cromatografia a scambio ionico viene utilizzata una soluzione elettrolitica come eluente. In questo caso, lo ione scambiato dell'eluente dovrebbe essere assorbito in modo meno selettivo rispetto a qualsiasi ione della miscela da separare.

Quando si esegue lo sviluppo della cromatografia a scambio ionico, che viene utilizzata più spesso, una colonna riempita con uno scambiatore ionico viene prima lavata con una soluzione elettrolitica fino a quando lo scambiatore ionico non sostituisce completamente tutti i suoi ioni con gli ioni contenuti nell'eluente. Quindi, un piccolo volume della soluzione di analita contenente ioni separabili in una quantità di circa l'1% della capacità dello scambiatore di ioni viene iniettato nella colonna. Successivamente, la colonna viene lavata con una soluzione eluente, prelevando frazioni dell'eluato e analizzandole.

Una miscela di ioni Cl - , Br - , J - può essere separata su una resina scambiatrice di anioni altamente basica (polistirene reticolato contenente gruppi di basi di ammonio quaternario N (CH 3) 3 +), ad esempio AB-17, che ha un intervallo di selettività (selettività): NO 3 - Cl – Br – J – . Di conseguenza, come eluente viene utilizzata una soluzione di NaNO 3. In primo luogo, questa soluzione viene fatta passare attraverso lo scambiatore di ioni fino a quando non è completamente saturata con ioni NO 3. Quando la miscela da separare viene introdotta nella colonna, gli ioni Cl – , Br – , J – vengono assorbiti dallo scambiatore anionico, spostando gli ioni NO 3 –. Durante il successivo lavaggio della colonna con una soluzione di NaNO 3, gli ioni Cl – , Br – , J – negli strati superiori dello scambiatore anionico vengono nuovamente sostituiti gradualmente da ioni NO 3 –. Gli ioni Cl- saranno spostati più velocemente di tutti, gli ioni J - rimarranno nella colonna più a lungo. La differenza nella selettività dello scambiatore di ioni rispetto agli ioni della miscela porta al fatto che nella colonna si formano zone separate di ioni adsorbiti Cl - , Br - e J - che si muovono lungo la colonna a velocità diverse. Man mano che ti muovi lungo la colonna, la distanza tra le zone aumenta. In ciascuna zona c'è solo uno degli anioni della miscela in separazione e l'anione dell'eluente, nell'intervallo tra le zone c'è solo un anione dell'eluente. Pertanto, le frazioni contenenti i singoli componenti della miscela da separare appariranno nell'eluente all'uscita della colonna.

Per risolvere problemi pratici, le condizioni per la separazione ionica vengono variate selezionando un'opportuna fase mobile (composizione, concentrazione, pH, forza ionica) o modificando la porosità della matrice polimerica dello scambiatore ionico, ovvero il numero di legami intercatena in la matrice, e creando setacci a scambio ionico permeabili ad alcuni ioni e capaci di scambiarli e impenetrabili ad altri. È anche possibile modificare la natura e la disposizione reciproca dei gruppi ionogenici, nonché ottenere assorbenti capaci di reazioni chimiche selettive dovute alla formazione complessa. Un'elevata selettività si possiede, ad esempio, complessando scambiatori di ioni contenenti nella loro struttura gruppi chelanti di reagenti organici dimetilgliossima, ditizone, 8-idrossichinolina, ecc., nonché eteri corona.

La più grande applicazione nella cromatografia a scambio ionico, ionico e a coppie di ioni si trova negli scambiatori di ioni organici sintetici a macro e microrete con una grande capacità di scambio (3–7 mmol/g), nonché nei materiali a scambio ionico inorganici. Gli scambiatori di ioni micromesh sono in grado di scambiare ioni solo nello stato gonfio, macromesh - negli stati gonfi e non gonfi. Un altro tipo strutturale di scambiatori di ioni sono gli scambiatori di ioni a film superficiale, il cui nucleo solido è costituito da un copolimero non poroso di stirene e divinilbenzene, vetro o gel di silice ed è circondato da un film sottile dello scambiatore di ioni. Il diametro totale di una tale particella è di circa 40 µm e lo spessore del film di ionite è di 1 µm. Lo svantaggio di tali scambiatori di ioni è il diametro delle particelle relativamente grande e la bassa capacità di scambio a causa della bassa area superficiale specifica, per cui è necessario lavorare con piccoli campioni e, di conseguenza, utilizzare rivelatori altamente sensibili. Inoltre, tali scambiatori di ioni vengono rapidamente avvelenati e non sono in grado di rigenerarsi.

Nella cromatografia ionica e a scambio ionico ad alte prestazioni, scambiatori di ioni di polistirene volumetrico-poroso, silici volumetrico-porose con un diametro del granulo di circa 10 μm e copolimeri di stirene e divinilbenzene con superficie ionogenica praticamente non rigonfianti Vengono utilizzati gruppi sulfo e amminici.

Nella cromatografia a coppia ionica vengono utilizzati assorbenti "a pennello": gel di silice con fasi invertite innestate C 2, C 8, C 18, che vengono facilmente convertiti in uno scambiatore cationico dopo l'assorbimento di tensioattivi ionici dalla fase mobile, ad esempio alchil solfati o sali di basi di ammonio quaternario.

Quando si esegue la separazione cromatografica utilizzando scambiatori di ioni, le soluzioni acquose di sali vengono spesso utilizzate come fase mobile. Ciò è dovuto al fatto che l'acqua ha eccellenti proprietà dissolventi e ionizzanti, grazie alle quali le molecole del campione analizzato si dissociano istantaneamente in ioni, i gruppi di scambio ionico dello scambiatore di ioni vengono idratati e assumono anche una forma completamente o parzialmente dissociata. Ciò garantisce un rapido scambio di controparti. La forza di eluizione della fase mobile è influenzata principalmente dal pH, dalla forza ionica, dalla natura della soluzione tampone, dal contenuto del solvente organico o del tensioattivo (cromatografia a coppia ionica).

Il valore del pH viene scelto in base alla natura dei gruppi ionogenici, degli ioni da separare e della matrice. È possibile lavorare con scambiatori di ioni fortemente acidi e fortemente basici a pH = 2–12, con quelli debolmente acidi a pH = 5–12 e con quelli debolmente basici a pH = 2–6. I sorbenti a base di silice non possono essere utilizzati a pH 9. La forza ionica della fase mobile influisce sulla capacità dello scambiatore di ioni. Con un aumento della forza ionica, l'assorbimento degli ioni di solito diminuisce, poiché aumenta la forza di eluizione della fase mobile. Pertanto, all'inizio della separazione, la fase mobile dovrebbe avere una bassa forza ionica (0,05–0,1) e il valore finale di questa caratteristica non dovrebbe superare 2. Nell'eluizione a gradiente, vengono spesso utilizzati tamponi con forza ionica crescente.

Per l'eluizione selettiva degli ioni assorbiti dallo scambiatore ionico si possono utilizzare acqua, soluzioni tampone (fosfato, acetato, borato, idrocarbonato, ecc.) con un determinato valore di pH e forza ionica, soluzioni di minerali (cloridrico, azoto, solforico, fosforico) e organici (fenolo, citrico, lattico, tartarico, ossalico, EDTA). La scelta dell'eluente è facilitata dal fatto che i coefficienti limite di distribuzione della maggior parte degli elementi tra soluzioni acquose (acqua-organiche) di molti complessanti e scambiatori ionici di tipo standard sono determinati e presentati in tabelle.

1.6.4. Cromatografia ad esclusione STERICA. La cromatografia ad esclusione dimensionale è un tipo di cromatografia liquida in cui la separazione dei componenti si basa sulla distribuzione delle molecole in base alla loro dimensione tra il solvente nei pori del sorbente e il solvente che scorre tra le sue particelle. Durante la separazione, piccole molecole entrano nella rete polimerica, nei pori di cui il solvente funge da fase stazionaria, e vi vengono trattenute. Le grandi molecole non possono penetrare nella rete polimerica e vengono lavate fuori dalla colonna dalla fase mobile. Vengono eluite prima le molecole più grandi, poi quelle medie e infine quelle piccole.

La cromatografia ad esclusione dimensionale è suddivisa in permeazione del gel e filtrazione del gel. Nella cromatografia a permeazione di gel, la separazione avviene su polimeri che si rigonfiano in solventi organici. La versione con filtrazione su gel della cromatografia ad esclusione dimensionale prevede l'uso di polimeri rigonfiabili in acqua come fasi stazionarie.

Il tempo di ritenzione dei componenti del campione analizzato nella colonna di esclusione dimensionale dipende dalla dimensione delle loro molecole e dalla diffusione nei pori del sorbente, nonché dalla dimensione dei pori della fase stazionaria.

In questo tipo di cromatografia liquida, il coefficiente di partizione D per le molecole più piccole del campione analizzato, che si muovono nella colonna cromatografica alla velocità più bassa, penetrando nella griglia della fase stazionaria, è uguale a 1, poiché la fase mobile e il solvente nei pori della fase stazionaria hanno la stessa composizione. In questo caso, assume la forma l'equazione principale della cromatografia su colonna

Le grandi molecole che non entrano nei pori della fase stazionaria vengono eluite dalla colonna insieme alla fase mobile. Per loro D= 0, a V R =V m. Tale intervallo di valori del coefficiente di distribuzione (da 0 a 1) è tipico solo per la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Tutte le molecole della sostanza multicomponente analizzata devono essere lavate fuori dalla colonna facendo passare un piccolo volume di solvente da V m prima di V m +V S e la separazione è completata prima che esca il picco di solvente. Pertanto, in questo tipo di cromatografia, è necessario utilizzare colonne sufficientemente lunghe con un grande volume libero. V m e un gran numero di pori nel sorbente.

La risoluzione dei picchi cromatografici nelle separazioni di esclusione dimensionale può essere migliorata utilizzando l'eluizione in gradiente con solventi misti.

Ogni sorbente utilizzato nella cromatografia ad esclusione dimensionale è caratterizzato da un certo volume dei pori e, quindi, ha una certa area di pesi molecolari separabili e una certa curva di calibrazione. In questo caso, la curva di calibrazione che caratterizza la dipendenza del volume trattenuto dal peso molecolare o dalla dimensione delle molecole, di regola, ha una forma complessa.

Le fasi stazionarie nella cromatografia ad esclusione dimensionale sono selezionate in base a compiti analitici specifici. Inizialmente, viene stabilito quale sistema di solventi può essere utilizzato per l'analisi (acquoso o acqua-organico). A seconda di ciò, viene determinato il tipo di assorbente. Se i campioni idrosolubili devono essere separati, ad esempio, come fasi stazionarie vengono utilizzati destrani reticolati rigonfiabili in acqua (Sephadex) o poliacrilammidi (Biogel P). La separazione delle sostanze solubili in solventi organici può essere effettuata su polistireni con vari gradi di reticolazione, che si rigonfiano in solventi organici (styrogel, poragel, biobid C). Tali gel gonfiati generalmente non sono stabili alla pressione e consentono portate di fase mobile molto basse, il che aumenta il tempo di analisi. Per implementare una versione altamente efficiente della cromatografia ad esclusione dimensionale, è necessario utilizzare fasi stazionarie con matrici rigide - gel di silice, il cui svantaggio - elevata attività di adsorbimento - viene eliminato dalla silanizzazione della superficie o dalla selezione di un eluente di polarità appropriata .

Le sostanze che possono essere utilizzate come fasi mobili nella cromatografia ad esclusione dimensionale sono:

 sciogliere completamente il campione analizzato;

 bagnare bene il sorbente;

 contrastare l'adsorbimento dei componenti del campione sul sorbente;

 hanno bassa viscosità e tossicità.

1.6.5. Cromatografia planare. La cromatografia planare comprende la cromatografia su strato sottile e su carta. Questi tipi di cromatografia liquida sono semplici nella tecnica, rapidi, non richiedono apparecchiature costose, che è il loro innegabile vantaggio.

La separazione di una miscela di sostanze con questi metodi può essere eseguita utilizzando vari sistemi cromatografici. Pertanto, si distinguono adsorbimento, distribuzione, fase normale e inversa, scambio ionico, ecc., Carta e cromatografia su strato sottile. Attualmente, la cromatografia su strato sottile è la più utilizzata.

La cromatografia su carta e su strato sottile ha una tecnica simile. La fibra di carta di cellulosa viene utilizzata come fase stazionaria nella cromatografia su carta, nella cromatografia su strato sottile - vari assorbenti (Al 2 O 3 , gel di silice, ecc.) Deposti in uno strato sottile uniforme (100-300 μm) su un vetro, metallo o supporto in plastica (supporto) . Lo strato adsorbente sul supporto può essere fissato o meno.

La separazione cromatografica nei metodi planari, oltre che su colonna, è dovuta al trasferimento dei componenti dell'analita da parte della fase mobile lungo lo strato della fase stazionaria a velocità diverse secondo i coefficienti di distribuzione delle sostanze da separare . In entrambi i casi vengono utilizzati sistemi cromatografici liquido-solido assorbente (meccanismo di separazione dell'adsorbimento), veicolo liquido-liquido-solido (distribuzione, scambio ionico e altri meccanismi).

Come fasi mobili vengono utilizzati vari solventi o loro miscele, acidi organici o inorganici.

L'ottenimento pratico di cromatogrammi planari consiste in quanto segue.

Su una striscia di carta cromatografica o su un sottile strato di assorbente, viene tracciata una linea di partenza con una matita a una distanza di 1 cm dal bordo inferiore della striscia o della lastra. Una micropipetta viene utilizzata per applicare un campione sulla linea di partenza sotto forma di un punto con un diametro non superiore a 2-3 mm. Quindi il bordo della striscia o piastra viene calato nel recipiente con la fase mobile, situato in una camera sigillata. Man mano che la fase mobile sale lungo la striscia o piastra e si verificano i molteplici atti elementari di assorbimento-desorbimento, distribuzione tra due fasi liquide, scambio ionico, ecc., comuni in cromatografia, i componenti della miscela analizzata vengono separati. Il processo viene generalmente continuato fino a quando il solvente non è passato dalla linea di partenza di 10 cm, dopodiché la striscia o la piastra viene rimossa dalla camera e asciugata. Se i componenti dell'analita sono colorati, danno le macchie di colore corrispondenti sul cromatogramma. Per rilevare i componenti non colorati dell'analita, è necessario sviluppare il cromatogramma. Lo sviluppo di un cromatogramma e la rilevazione dei componenti del campione possono essere effettuati con vari metodi e dipendono dalla composizione delle miscele analizzate. La manifestazione può essere effettuata:

-Utilizzo di luce UV. Il metodo è applicabile per la rivelazione di sostanze in grado di emettere la propria radiazione (luminescenza) nella gamma di lunghezze d'onda del visibile sotto l'azione dei raggi UV;

 per mezzo di reagenti-sviluppatori. Ad esempio, la presenza di amminoacidi nella miscela analizzata può essere rilevata utilizzando la ninidrina. Il cromatogramma essiccato viene immerso in una soluzione allo 0,2% di ninidrina in acetone, quindi essiccato. Le macchie corrispondenti ai vari componenti della miscela acquisiscono un colore visivo e, di regola, specifico per ciascuna sostanza;

- usando iodio. In questo caso, il cromatogramma rilevato viene introdotto in un recipiente, sul fondo del quale sono presenti cristalli di iodio. I vapori di iodio vengono adsorbiti sui punti in modo più forte, grazie al quale vengono visualizzati i punti. Lo iodio è un reagente sviluppatore non specifico. Utilizzando specifici reagenti è possibile non solo determinare il numero di componenti di una miscela, ma anche identificare le sostanze separate dal colore delle macchie.

La cromatografia su carta e su strato sottile viene spesso eseguita nella cosiddetta variante ascendente sopra descritta. Abbastanza spesso, per migliorare la qualità dei cromatogrammi, è necessario utilizzare varianti più complesse della cromatografia planare, ad esempio top-down, circolare, bidimensionale. Nella cromatografia su carta o su strato sottile, l'analita viene applicato alla linea di partenza della lastra o della striscia di carta in alto e l'eluente viene alimentato dall'alto anziché dal basso. L'effetto positivo, che è quello di migliorare la separazione, è dovuto al contributo al processo di separazione della gravità dei componenti.

Sia la cromatografia a monte che quella a valle possono essere eseguite in versione mono e bidimensionale. Contrariamente al processo di separazione a letto piano unidimensionale descritto sopra, nella separazione cromatografica bidimensionale, la separazione del campione analizzato viene eseguita prima in un solvente, quindi la separazione viene eseguita nella direzione perpendicolare al primo, utilizzando un altro solvente, ruotando il primo cromatogramma di 90°C.

Nella cromatografia circolare, l'analita viene applicato come una goccia nel mezzo di una lastra o di un foglio di carta cromatografica. Qui vengono anche aggiunti goccia a goccia uno o più solventi. Ciò porta al fatto che il cromatogramma risultante è un insieme di macchie radiali.

La posizione degli spot (zone) che formano i componenti separati dell'analita su un cromatogramma piatto è caratterizzata dai valori della velocità relativa di movimento dei componenti in uno strato sottile R fi. Valore sperimentale R fi definito come il rapporto tra la distanza l io, passato io-esimo componente, alla distanza l passato dal solvente dalla linea di partenza alla linea del fronte (Fig. 1.10):

Valore R fi dipende dalla natura del componente rilevante del campione analizzato, dalla natura della fase stazionaria, dal suo spessore, dalla natura e dalla qualità della fase mobile, dal metodo di applicazione del campione e da altri fattori, ma sempre R fi 1.

Valore R fiè in realtà identico al tempo di ritenzione di una sostanza o al suo volume di ritenzione, che caratterizza la velocità di passaggio di una sostanza attraverso una colonna cromatografica, e può essere utilizzato per l'identificazione qualitativa dei componenti del campione analizzato, e il diametro dello spot è identico all'altezza o all'area del picco cromatografico e, quindi, in una certa misura riflette il contenuto quantitativo della sostanza.

La determinazione quantitativa della composizione del campione analizzato nel caso più semplice può essere valutata visivamente dall'intensità del colore intrinseco delle macchie o dall'intensità del bagliore fluorescente delle macchie ottenute durante il rilevamento UV. Per questi scopi, è ampiamente utilizzata l'eluizione di spot cromatografici. In questo caso, la macchia ottenuta sul cromatogramma viene accuratamente ritagliata o raschiata, trattata con un solvente adatto e la soluzione risultante viene esaminata con il metodo fisico-chimico appropriato. Puoi anche usare il metodo gravimetrico, in cui il punto corrispondente viene ritagliato dal cromatogramma e pesato. La quantità di sostanza è determinata dalla differenza tra i pesi di carta pulita della stessa area e carta con la sostanza.

Carta (BH ) e cromatografia su strato sottile (TLC ) secondo il meccanismo di separazione a cui appartengono cromatografia di partizione . Nel metodo HD, il corriere è uno speciale carta cromatografica con determinate proprietà. Fase stazionaria è acqua adsorbita sulla superficie e sui pori della carta (fino al 20%), mobile - solvente organico, miscibile o immiscibile con acqua, acqua o soluzioni elettrolitiche.

Meccanismo abbastanza complicato sulla carta. Nella fase stazionaria la sostanza può essere trattenuta non solo per dissoluzione nell'acqua adsorbita dalla carta, ma anche essere adsorbito direttamente la cellulosa. Disegnato su carta componenti condivisi passano nella fase mobile e si muovono attraverso i capillari della carta a velocità diverse secondo coefficiente di distribuzione interfacciale ognuno di loro. All'inizio cromatografia parte della sostanza dalla carta passa fase mobile E vai avanti. Quando il solvente organico raggiunge l'area della carta che non contiene il soluto, ridistribuzione : dalla fase organica, la sostanza passa alla fase acquosa, assorbita su carta. Dal momento che i componenti sono diversi affinità per il sorbente , spostando l'eluente si verifica la separazione: alcune sostanze sono ritardate all'inizio del percorso, altre si spostano ulteriormente. Qui sono combinati Termodinamico (stabilimento di una distribuzione di equilibrio delle sostanze tra le fasi) e cinetico (componenti in movimento a velocità diverse) aspetti di separazione. Di conseguenza, ogni componente è concentrato su un'area specifica del foglio di carta: zone dei singoli componenti sul cromatogramma . L'uso della cromatografia su carta presenta una serie di svantaggi significativi: la dipendenza del processo di separazione dalla composizione e dalle proprietà della carta, la variazione del contenuto d'acqua nei pori della carta con variazioni delle condizioni di conservazione, una cromatografia molto bassa velocità (fino a diversi giorni) e bassa riproducibilità dei risultati. Queste carenze influiscono seriamente sulla diffusione della cromatografia su carta come metodo cromatografico.

V Metodo TLC il processo di separazione di una miscela di sostanze viene effettuato in uno strato sottile assorbente depositato su un substrato solido inerte, e fornito dal movimento fase mobile (solvente) attraverso il sorbente sotto l'azione di forze capillari . Dimeccanismo di separazione distinguere cromatografia di partizione, adsorbimento e scambio ionico . La separazione dei componenti avviene in questi casi sia per il loro diverso coefficiente di distribuzione tra le due fasi liquide ( cromatografia di partizione ), o per la diversa adsorbibilità dei composti da parte del sorbente ( cromatografia ad adsorbimento ). Il metodo di adsorbimento si basa su diversi gradi di assorbimento-desorbimento dei componenti separati sulla fase stazionaria. Adsorbimento effettuato a spese forze di van der Waals , che è la base adsorbimento fisico , polimolecolare (formazione di più strati di adsorbato sulla superficie dell'adsorbente) e chemisorbimento (interazione chimica di adsorbente e adsorbato).

Nel caso di utilizzo di tali assorbenti per TLC come allumina o gel di silice svolgere un ruolo nella separazione distribuzione , e adsorbimento sulla superficie attiva sviluppata del sorbente (150–750 m2/g). Distribuzione componenti della miscela si verifica tra l'acqua sulla superficie del supporto (ad es adsorbenti , come allumina , amido , cellulosa , farina fossile - e acqua modulo fase stazionaria ), e il solvente che si muove attraverso questa fase stazionaria ( fase mobile ). Il componente della miscela che è più facilmente solubile in acqua si muove più lentamente di quello che è più facilmente solubile nella fase mobile.

Adsorbimento manifestato nel fatto che tra vettore , ad esempio, vengono fissati l'ossido di alluminio e i componenti della miscela equilibri di adsorbimento - per ogni componente il suo, il cui risultato è velocità di marcia diversa componenti della miscela. Si possono distinguere due casi estremi:

a) la concentrazione della sostanza sull'adsorbente è zero. La sostanza si dissolve completamente nella fase mobile e ne viene portata via (si muove con fronte solvente ).

b) la sostanza è completamente adsorbita, non interagisce con il solvente e rimane all'inizio.

In pratica, con la sapiente selezione di solvente e adsorbente distribuzione i composti si trovano tra questi casi estremi e la sostanza gradualmente trasportato da uno strato assorbente all'altro a causa di processi simultanei assorbimento e desorbimento .

Viene chiamato il solvente che passa attraverso il sorbente eluente , il processo di spostamento di una sostanza insieme a un eluente  eluizione . Man mano che il liquido si muove sul piatto, la miscela di sostanze si separa per azione delle forze adsorbimento , distribuzione , scambio ionico o una combinazione di tutti questi fattori. Di conseguenza, separati zone cromatografiche componenti della miscela, cioè si scopre cromatogramma .

Selezione corretta assorbente e eluente determina l'efficienza della separazione della miscela. La mobilità della sostanza in esame dipende dalla sua affinità per il sorbente e forza di eluizione (polarità) dell'eluente. All'aumentare della polarità del composto, aumenta anche la sua affinità per il sorbente polare. Aumentando il grado di adsorbimento gel di silice i composti organici sono disposti in fila: idrocarburi<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь per gel di silice gli eluenti possono essere disposti in ordine crescente di "polarità" ( potere di eluizione ) e formano una serie di solventi ( serie eluotropica ) secondo dati sperimentali: alcani> benzene> cloroformio> etere dietilico> acetato di etile> alcoli С 2 -С 4> acqua> acetone> acido acetico> metanolo. Pertanto, un composto polare, l'alcol, viene adsorbito abbastanza fortemente sul gel di silice e, quindi, si muove debolmente sotto l'azione di un solvente non polare come l'esano e rimane vicino alla linea di partenza. A sua volta, l'idrocarburo aromatico non polare bifenile è notevolmente più mobile in esano, ma anche qui, per ottenere R F circa 0,5, è necessario un eluente aprotico più polare, il cloruro di metilene. forza dell'eluente regolare usando miscele di solventi - vicini di casa serie eluotropica con polarità diversa.

Attualmente, TLC utilizza principalmente quanto segue assorbenti : per la separazione sostanze lipofile  gel di silice , allumina , cellulosa acetilata , poliammidi ; separare sostanze idrofile  cellulosa , scambiatori di ioni di cellulosa , farina fossile , poliammidi . La caratteristica più importante di un assorbente è la sua attività , cioè. capacità assorbire (tenere) i componenti della miscela da separare. All'estero, diverse aziende producono gel di silice , farina fossile e allumina con l'aggiunta del 5% di gesso, che viene utilizzato per fissare lo strato assorbente nell'autoproduzione di lastre.

Il assorbente più comune è gel di silice - acido silicico idratato, formato dall'azione di acidi minerali su Na 2 SiO 3 ed essiccando il sol risultante. Dopo aver macinato il sol, si utilizza una frazione di una certa granulometria (indicata sulla piastra, solitamente 5-20 micron). gel di silice è un assorbente polare con gruppi OH come centri attivi. Assorbe facilmente l'acqua sulla superficie e forma legami a idrogeno.

Allumina è un adsorbente debolmente basico e viene utilizzato principalmente per la separazione di composti debolmente basici e neutri. Lo svantaggio delle lastre su ossido di alluminio è l'attivazione obbligatoria della superficie prima dell'uso in una camera di essiccazione ad alta temperatura (100-150 o C) e la bassa capacità di adsorbimento dello strato rispetto al gel di silice.

farina fossile - adsorbente ottenuto da minerali naturali - terre di diatomee. Il sorbente ha proprietà idrofile e una capacità di adsorbimento dello strato inferiore rispetto al gel di silice.

Cellulosa: le piastre a strato sottile rivestite di cellulosa sono molto efficaci nella separazione di molecole organiche complesse. L'adsorbente è costituito principalmente da palline di cellulosa con un diametro fino a 50 micron, fissate sul supporto con amido. Come nella cromatografia su carta, l'aumento del fronte del solvente è molto lento.

Analisi cromatografica viene eseguito su lastre industriali di produzione ceca " Silufo » (« Silufo "") di foglio di alluminio, a volte rinforzato con cartone, e " Siluplast » in plastica rivestita con uno strato di assorbenti - gel di silice LS 5-40 con amido o gesso come legante (fino al 10%) o ossido di alluminio con o senza indicatori fluorescenti. record" Silufo » hanno un'elevata velocità di eluizione, tuttavia sono caratterizzati da un basso potere di separazione e da una bassa sensibilità. Durante lo stoccaggio sono sensibili alle condizioni (umidità, temperatura, fluidi aggressivi, ecc.). Fornitura delle singole aziende lastre cromatografiche con uno strato di assorbente di diverso (solitamente fino a 0,25 mm), ma rigorosamente costante spessore (gel di silice, cellulosa, resina a scambio ionico), su vetro e supporti in foglio di alluminio, plastica, fibra di vetro impregnata.

Piatti " Sorbfil » (TU 26-11-17-89) sono prodotti in Russia su una base polimerica (polietilentereftalato, grado P) o un substrato di alluminio (grado AF) con uno strato di lavoro applicato assorbente in gel di silice microfrazionato gradi STX-1A e STX-1VE (prodotto in URSS come gel di silice frazionato KSKG) con uno spessore di 90-120 micron (fino a 200 micron), fissato con un legante speciale - silicasolo . Quando si utilizza il sol di acido silicico (silicazolo) come legante, che si trasforma in gel di silice dopo il riscaldamento, le piastre TLC risultanti sono costituite da due componenti: uno strato di gel di silice e un substrato. L'uniformità dello spessore dello strato assorbente su una piastra è di ±5 µm. Esempio di designazione: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UV (10x10)" - lastre TLC ad alte prestazioni su un substrato di alluminio, con un fosforo, 10x10 cm.

Se viene utilizzato un substrato di vetro (grado C), tali lastre sono riutilizzabili e chimicamente resistenti. La loro resistenza chimica è determinata dalla resistenza chimica del gel di silice. Di conseguenza, le piastre TLC possono essere trattate ripetutamente con reagenti aggressivi, ad esempio con una miscela di cromo caldo, che rimuove le restrizioni sull'uso di reagenti correlati per il rilevamento di macchie e la modifica del sorbente e consente molteplici (fino a 30 volte o più) rigenerazione delle piastre con una miscela di cromo. Le lastre di vetro possono essere tagliate alla misura desiderata. La resistenza meccanica dello strato assorbente può essere controllata, prevedendo, da un lato, il trasporto e la lavorazione multipla delle lastre e, dall'altro, la possibilità di estrarre strati adsorbenti con sostanze separate per il successivo lavaggio dei singoli composti dalla assorbente e loro ulteriore studio con metodi strumentali (spettrometria IR e UV). , metodi di diffrazione di raggi X, NMR, ecc.).

Le lastre si differenziano per la dimensione delle frazioni (distribuzione delle particelle) del gel di silice che costituisce lo strato. Sulle piastre analitiche (grado A) la frazione è di 5-17 micron, su quelle ad alta efficienza (grado B) - 8-12 micron. Una distribuzione più stretta aumenta l'efficienza delle piastre, ad es. le macchie delle sostanze da separare diventano più compatte (di dimensioni inferiori) e quindi sono meglio separate quando il fronte dell'eluente percorre una distanza minore. Sui wafer russi, gli strati analitici e ad alte prestazioni non differiscono molto, a differenza dei wafer Merck (Germania). Se le sostanze non possono essere separate su piastre analitiche, devono essere utilizzate piastre ad alte prestazioni. Le lastre di tutte le modifiche sono prodotte con un fosforo (grado UV) con eccitazione di 254 nm. La shelf life non è limitata, i piatti" Sorbfil » ampiamente testato nell'analisi di derivati aminoacidici, pesticidi, lipidi, antibiotici.

Si esegue il metodo TLC identificazione qualitativa componenti. quantificazione per TLC è anche possibile, ciò richiede l'applicazione della quantità esatta di sostanza e aggiuntiva studi densitometrici con una chiara fissazione dell'intensità delle macchie. Il più comune è metodo semiquantitativo . È basato su confronto visivo la dimensione e l'intensità di una macchia componente con le caratteristiche corrispondenti di una serie di macchie della stessa sostanza di diverse concentrazioni ( soluzioni standard di riferimento ). Quando si utilizza un campione nella quantità di 1-5 μg, un metodo così semplice fornisce un'accuratezza nella determinazione del contenuto del componente di circa il 5-10%. Spesso, per determinare i componenti di un campione, è necessario effettuare la preparazione del campione per ottenere una miscela contenente i composti analizzati. La preparazione del campione si basa sull'estrazione di farmaci dal campione con solventi organici ( n-esano, etere di petrolio, etere dietilico, cloroformio), purificazione dell'estratto e successiva cromatografia in strato sottile di allumina o gel di silice.

Esistono diverse varianti di TLC e BC, che differiscono nel modo fornitura di solventi . A seconda della direzione di movimento della fase mobile si hanno:

un)cromatografia ascendente  la fase mobile viene versata sul fondo della camera di separazione, la carta (piatto) viene posta in verticale;

B)cromatografia discendente  la fase mobile viene alimentata dall'alto e scende lungo lo strato assorbente della lastra o della carta;

v)cromatografia radiale  avanzamento orizzontale del fronte solvente: la fase mobile viene portata al centro del disco di carta (piatto), dove viene depositata la miscela da separare.

Il più comune è eluizione verso l'alto (cromatografia). Davanti eluente mentre ci si sposta dal basso verso l'alto. La scelta del solvente (fase mobile) è determinata dalla natura del assorbente e dalle proprietà delle sostanze da separare.

Separazione cromatografica I metodi BC e TLC vengono eseguiti in camera di separazione con coperchio avvitato. Una misura quantitativa della velocità di trasferimento di una sostanza utilizzando uno specifico adsorbente e solvente è valore R F (dall'inglese. ritenzione fattore – coefficiente di ritardo, questo parametro è analogo al tempo di ritenzione). Posizione zone del componente cromatografato impostare su misura coefficiente R F uguale al rapporto tra la velocità della sua zona e la velocità del fronte del solvente. Valore R F è sempre inferiore all'unità e non dipende dalla lunghezza del cromatogramma. Per l'importo R F influenzato da vari fattori. Quindi, a basse temperature, le sostanze si muovono più lentamente; contaminazione del solvente, disomogeneità dell'adsorbente, ioni estranei nella soluzione analizzata possono modificare il valore R F fino a 10%. Nel sistema selezionato, gli analiti devono avere valori diversi R F e distribuito su tutta la lunghezza del cromatogramma. È auspicabile che i valori R F giaceva nell'intervallo 0,05-0,85.

In pratica, il valore R F calcolato come rapporto della distanza l percorsa dalla sostanza fino alla distanza l passato dal solvente:

R F = ll (6.1 )

Di solito per il calcolo scegliere punto centrale (Fig. 1). Valore R F dipende da molti fattori come carta cromatografica (la sua porosità, densità, spessore, grado di idratazione) e assorbente (granulometria, natura dei gruppi sulla superficie, spessore dello strato, suo contenuto di umidità, natura della sostanza, composizione della fase mobile), condizioni sperimentali (temperatura, tempo di cromatografia, ecc.). Con la costanza di tutti i parametri cromatografici, il valore R F determinato solo dalle singole proprietà di ciascun componente.

Riso. 1. Determinazione dei valori sul cromatogramma RF per i componenti UN e V,

il loro grado di separazione Rs e il numero di piastre teoriche n .

Anche l'efficienza di BC e TLC dipende selettività e sensibilità reazioni utilizzate per rilevare i componenti della miscela analizzata. Di solito vengono utilizzati reagenti che formano composti colorati con i componenti da determinare: gli sviluppatori. Per un più affidabile identificazione delle componenti condivise applicare " Testimoni » -soluzioni sostanze standard (nello stesso solvente del campione) che dovrebbero essere presenti nel campione. Sostanza standard applicato sulla linea di partenza accanto al campione analizzato e cromatografato nelle stesse condizioni. In pratica si usa spesso un valore relativo:

R F rel = R F X / R F In piedi (6.2)

dove R F In piedi calcolato anche con la formula (6.1). Efficienza separazione cromatografica caratterizzare numero di piastre teoriche equivalenti e loro altezza . Quindi, nel metodo TLC, il numero di piastre teoriche equivalenti n UN per componente UN la miscela da separare si calcola con la formula:

n UN = 16 (l OA / un (UN )) 2 (6.3)

I valori l OA e un (UN ) determinato come mostrato in Fig. 6.1. Quindi l'altezza della piastra teorica equivalente h UN è:

h UN = l OA /N = un (UN ) 2 / 16 l OA . (6.4)

La separazione è praticamente possibile se R F (UN)  R F (V)  0,1 .

Caratterizzare la separazione di due componenti UN e V uso grado (criterio) di divisione Rs :

Rs =  l / (un (UN) / 2 + un (B) / 2)= 2  l / (un (UN) + un (B)) (6.5)

dove  l  distanza tra i centri dei punti dei componenti UN e V;

un (UN) e un (V)  diametri spot UN e V sul cromatogramma (Fig. 6.1). Più Rs , più chiaramente sono separate le macchie dei componenti UN e V sul cromatogramma. Condizioni cromatografia sono scelti in modo che il valore Rs diverso da zero e uno, il valore ottimale Rs è 0,3  0.7. Per tariffa selettività di separazione due componenti UN e V uso fattore di separazione α :

α = l B / l UN (6.6)

Se α = 1, allora le componenti UN e V non sono separati.