Vlastnosti použitia vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie vo farmaceutických výrobkoch. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia prírodných a odpadových vôd Podstata metódy kvapalinovej chromatografie

"Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia prírodných a odpadových vôd znečisťujúcich látok"

Úvod

Kapitola 1. Základné pojmy a klasifikácia metód kvapalinovej chromatografie

1.1 Prístroj na kvapalinovú chromatografiu

Kapitola 2. Podstata HPLC

2.1 Aplikácia

Kapitola 3. Príklady použitia HPLC pri analýze objektov prostredia

Kapitola 4 Prístrojové vybavenie HPLC

Literatúra

Dodatok

Úvod

Chromatografické metódy sú často nevyhnutné na identifikáciu a kvantifikáciu organických zlúčenín s podobnou štruktúrou. Najpoužívanejšie na rutinnú analýzu látok znečisťujúcich životné prostredie sú plynová a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Plynovochromatografická analýza organických polutantov v pitných a odpadových vodách bola spočiatku založená na použití náplňových kolón, neskôr sa rozšírili aj kremenné kapilárne kolóny. Vnútorný priemer kapilárnych kolón je zvyčajne 0,20-0,75 mm, dĺžka - 30-105 m Optimálne výsledky pri analýze kontaminantov vo vode sa najčastejšie dosahujú pri použití kapilárnych kolón s rôznou hrúbkou filmu z metylfenyl silikónov s obsahom fenyl skupiny 5 a 50 %. Systém vstrekovania vzoriek sa často stáva zraniteľným miestom v chromatografických technikách využívajúcich kapilárne kolóny. Systémy vstrekovania vzoriek možno rozdeliť do dvoch skupín: univerzálne a selektívne. Medzi univerzálne patria vstrekovacie systémy s a bez rozdelenia prúdu, „studené“ vstrekovanie do kolóny a odparovanie s programovaním teploty. Selektívne vstrekovanie využíva čistenie s prechodným zachytávaním, analýzou headspace atď. Pri použití univerzálnych vstrekovacích systémov sa do kolóny dostáva celá vzorka, pri selektívnom vstrekovaní sa zavádza len určitá frakcia. Výsledky získané selektívnym vstrekovaním sú výrazne presnejšie, pretože frakcia, ktorá vstúpila do kolóny, obsahuje iba prchavé látky a techniku je možné plne automatizovať.

Plynovochromatografické detektory používané pri monitorovaní znečisťujúcich látok sa často delia na univerzálne detektory, ktoré reagujú na každú zložku v mobilnej fáze, a selektívne detektory, ktoré reagujú na prítomnosť určitej skupiny látok s podobnými chemickými vlastnosťami v mobilnej fáze. Medzi univerzálne patrí plameňová ionizácia, atómová emisia, hmotnostné spektrometrické detektory a infračervená spektrometria. Selektívne detektory používané pri analýze vody sú elektrón-záchytné (selektívne pre látky obsahujúce atómy halogénu), termionické (selektívne pre zlúčeniny obsahujúce dusík a fosfor), fotoionizačné (selektívne pre aromatické uhľovodíky), detektor elektrolytickej vodivosti (selektívny pre zlúčeniny, obsahujúce halogén atómy síry a dusíka). Minimálne zistiteľné množstvá látok sa pohybujú od nanogramov po pikogramy za sekundu.

Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia(HPLC) je ideálna metóda na stanovenie veľkého množstva tepelne nestabilných zlúčenín, ktoré nie je možné analyzovať pomocou plynovej chromatografie. V súčasnosti sa moderné agrochemikálie, vrátane metylkarbonátov a organofosforových insekticídov a iných neprchavých látok, často stávajú predmetom analýzy kvapalinovou chromatografiou. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) si získava na popularite medzi inými metódami používanými pri monitorovaní životného prostredia aj preto, že má dobré vyhliadky v oblasti automatizácie prípravy vzoriek.

KAPITOLA 1. ZÁKLADNÉ POJMY A KLASIFIKÁCIA METÓD KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE

Kvapalinová chromatografia je rozdelená do niekoľkých tried v závislosti od typu stacionárnej fázy. Jednoduché prístrojové vybavenie papierovej a tenkovrstvovej chromatografie viedlo k širokému použitiu týchto metód v analytickej praxi. Veľké možnosti kolónovej kvapalinovej chromatografie však podnietili zlepšenie vybavenia pre túto klasickú metódu a viedli k rýchlemu zavedeniu HPLC. Prechod eluentu cez kolónu pod vysokým tlakom umožnil výrazne zvýšiť rýchlosť analýzy a výrazne zvýšiť účinnosť separácie vďaka použitiu jemne dispergovaného sorbentu. Metóda HPLC v súčasnosti umožňuje izolovať, kvantitatívne a kvalitatívne analyzovať zložité zmesi organických zlúčenín.

Podľa mechanizmu interakcie separovanej látky (eluátu) so stacionárnou fázou sa rozlišuje adsorpčná, distribučná, iónomeničová, veľkostne vylučovacia, iónovo-párová, ligandovo-výmenná a afinitná chromatografia.

Adsorpčná chromatografia. Separácia adsorpčnou chromatografiou sa uskutočňuje ako výsledok interakcie separovanej látky s adsorbentom, ako je oxid hlinitý alebo silikagél, ktorý má na povrchu aktívne polárne centrá. Rozpúšťadlo (eluent) je nepolárna kvapalina. Mechanizmus sorpcie spočíva v špecifickej interakcii medzi polárnym povrchom sorbentu a polárnymi (alebo polarizovanými) oblasťami molekúl analyzovanej zložky (obr. 1).

Ryža. 1. Adsorpčná kvapalinová chromatografia.

Deliaca chromatografia. V distribučnej verzii kvapalinovej chromatografie sa separácia zmesi látok uskutočňuje v dôsledku rozdielu v ich distribučných koeficientoch medzi dvoma nemiešateľnými fázami - eluentom (mobilná fáza) a fázou umiestnenou na sorbente (stacionárna fáza).

o normálna fáza Deliaca kvapalinová chromatografia využíva nepolárny eluent a polárne skupiny naočkované na povrch sorbentu (najčastejšie silikagél). Ako povrchové modifikátory silikagélu (viazané fázy) sa používajú substituované alkylchlórsilány obsahujúce polárne skupiny, ako je nitril, aminoskupina atď. (obr. 2). Použitie viazaných fáz umožňuje jemné riadenie sorpčných vlastností povrchu stacionárnej fázy a dosiahnutie vysokej účinnosti separácie.

Ryža. 2. Deliaca chromatografia s naviazanou fázou (variant s normálnou fázou).

obrátená fáza kvapalinová chromatografia je založená na rozdelení zložiek zmesi medzi polárny eluent a nepolárne skupiny (dlhé alkylové reťazce) naočkované na povrch sorbentu (obr. 3).

Ryža. 3. Deliaca chromatografia s naviazanou fázou (verzia s obrátenými fázami).

Menej rozšírený je variant kvapalinovej chromatografie na nosiči, pri ktorom sa kvapalná stacionárna fáza nanáša na stacionárny nosič.

Exkluzívne (prenikajúce do gélu) Chromatografia je variant kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k separácii látok v dôsledku distribúcie molekúl medzi rozpúšťadlom nachádzajúcim sa v póroch sorbentu a rozpúšťadlom prúdiacim medzi jeho časticami.

afinný Chromatografia je založená na špecifických interakciách separovaných proteínov (protilátok) s látkami (antigénmi) naočkovanými na povrch sorbentu (syntetickej živice), ktoré selektívne tvoria komplexy (konjugáty) s proteínmi.

Iónovo-výmenná, iónovo-párová a ligandovo-výmenná chromatografia sa používa hlavne v anorganickej analýze.

Základné parametre chromatografickej separácie.

Hlavnými parametrami chromatografickej separácie sú retenčný objem a retenčný čas zložky zmesi (obr. 4).

Retenčný čas tR je čas, ktorý uplynie od okamihu vstreknutia vzorky do kolóny až do dosiahnutia maxima zodpovedajúceho píku. Vynásobením retenčného času objemovou rýchlosťou eluentu F dostaneme retenčný objem VR:

Korigovaný retenčný čas je čas, ktorý uplynie od okamihu, keď sa objaví vrchol nesorbovateľnej zložky, po vrchol zodpovedajúcej zlúčeniny:

tR" = tR - t0 ;

Normalizovaný alebo korigovaný retenčný objem je retenčný objem korigovaný na mŕtvy objem kolóny V0, t. j. retenčný objem nesorbovateľnej zložky:

VR" = VR - V0;

Retenčnou charakteristikou je aj kapacitný koeficient k", definovaný ako pomer hmotnosti látky v stacionárnej fáze k hmotnosti látky v mobilnej fáze: k" = mn / mp;

Hodnota k" sa dá ľahko určiť z chromatogramu:

Najdôležitejšími parametrami chromatografickej separácie sú jej účinnosť a selektivita.

Účinnosť kolóny, meraná výškou teoretických poschodí (HETP) a nepriamo úmerná ich počtu (N), je tým vyššia, čím užší je pík látky vznikajúci pri rovnakom retenčnom čase. Hodnotu účinnosti možno vypočítať z chromatogramu pomocou nasledujúceho vzorca:

N = 5,54. (tR / 1/2) 2,

kde tR- čas držania,

w 1/2 - šírka píku v polovici výšky

Keď poznáme počet teoretických poschodí na kolónu, dĺžku kolóny L a priemerný priemer zŕn dc sorbentu, je ľahké získať hodnoty ekvivalentnej výšky teoretickej úrovne (HETP) a zníženej výšky (PHETP):

HETP = L/N PHETP = HETP/d c

Tieto charakteristiky umožňujú porovnávať účinnosť kolón rôznych typov, hodnotiť kvalitu sorbentu a kvalitu plnenia kolón.

Selektivita separácie dvoch látok je určená rovnicou:

Pri uvažovaní o separácii zmesi dvoch zložiek je dôležitým parametrom aj stupeň separácie RS:

;

Píky sa považujú za vyriešené, ak je hodnota RS väčšia alebo rovná 1,5.

Hlavné chromatografické parametre súvisia s nasledujúcou rovnicou pre rozlíšenie:

;

Faktory, ktoré určujú selektivitu separácie, sú:

1) chemická povaha sorbentu;

2) zloženie rozpúšťadla a jeho modifikátorov;

3) chemická štruktúra a vlastnosti zložiek zmesi, ktorá sa má oddeliť;

4) teplota kolóny

1.1 Prístroj na kvapalinovú chromatografiu

V modernej kvapalinovej chromatografii sa používajú prístroje rôzneho stupňa zložitosti – od najjednoduchších systémov až po špičkové chromatografy vybavené rôznymi prídavnými zariadeniami.

Na obr. Obrázok 4 zobrazuje blokovú schému kvapalinového chromatografu obsahujúceho minimálnu požadovanú sadu komponentov, v tej či onej forme, prítomných v akomkoľvek chromatografickom systéme.

Ryža. 4. Bloková schéma kvapalinového chromatografu.

Čerpadlo (2) je navrhnuté tak, aby vytváralo konštantný prietok rozpúšťadla. Jeho dizajn je určený predovšetkým prevádzkovým tlakom v systéme. Na prevádzku v rozsahu 10-500 MPa sa používajú piestové (striekačky) alebo piestové čerpadlá. Nevýhodou prvého je nutnosť periodických prestávok na plnenie eluentom a druhým veľká zložitosť konštrukcie a v dôsledku toho vysoká cena. Pre jednoduché systémy s nízkymi prevádzkovými tlakmi 1-5 MPa sa úspešne používajú lacné peristaltické čerpadlá, ale keďže je ťažké dosiahnuť konštantný tlak a prietok, ich použitie je obmedzené na prípravné úlohy.

Injektor (3) zabezpečuje vstrekovanie vzorky zmesi separovaných zložiek do kolóny s dostatočne vysokou reprodukovateľnosťou. Jednoduché systémy vstrekovania vzoriek „stop-flow“ vyžadujú zastavenie čerpadla, a preto sú menej pohodlné ako slučkové pipety Reodyne.

HPLC kolóny (4) sú hrubostenné rúrky z nehrdzavejúcej ocele schopné odolať vysokému tlaku. Dôležitú úlohu zohráva hustota a rovnomernosť naplnenia kolóny sorbentom. Pre nízkotlakovú kvapalinovú chromatografiu sa úspešne používajú hrubostenné sklenené kolóny. Teplotnú stálosť zabezpečuje termostat (5).

Detektory (6) pre kvapalinovú chromatografiu majú prietokovú kyvetu, v ktorej sa kontinuálne merajú niektoré vlastnosti prúdiaceho eluentu. Najpopulárnejšími typmi detektorov na všeobecné použitie sú refraktometre, ktoré merajú index lomu, a spektrofotometrické detektory, ktoré merajú absorbanciu rozpúšťadla pri pevnej vlnovej dĺžke (zvyčajne v ultrafialovej oblasti). Medzi výhody refraktometrov (a nevýhody spektrofotometrov) patrí nízka citlivosť na typ stanovovanej zlúčeniny, ktorá nemusí obsahovať chromoforové skupiny. Na druhej strane je použitie refraktometrov obmedzené na izokratické systémy (s konštantným zložením eluentu), takže použitie gradientu rozpúšťadla v tomto prípade nie je možné.

HPLC kolóny, ktoré sa najčastejšie používajú pri analýze environmentálnych polutantov, sú 25 cm dlhé a 4,6 mm vnútorný priemer a sú naplnené 5-10 µm sférickými časticami silikagélu naočkovanými oktadecylovými skupinami. V posledných rokoch sa objavili kolóny s menším vnútorným priemerom naplnené menšími časticami. Použitie takýchto kolón znižuje spotrebu rozpúšťadiel a dobu trvania analýzy, zvyšuje citlivosť a účinnosť separácie a tiež uľahčuje problém pripojenia kolón k spektrálnym detektorom. Kolóny s vnútorným priemerom 3,1 mm sú vybavené bezpečnostnou patrónou (predkolónou) pre zvýšenie životnosti a zlepšenie reprodukovateľnosti analýz.

Ako detektory v moderných HPLC prístrojoch sa zvyčajne používa UV detektor na diódovom poli, fluorescenčné a elektrochemické detektory.

Treba mať na pamäti, že v praktickej práci často prebieha separácia nie jedným, ale viacerými mechanizmami súčasne. Takže separácia vylúčenia môže byť komplikovaná adsorpčnými efektmi, adsorpciou - distribúciou a naopak. V tomto prípade platí, že čím väčší je rozdiel v látkach vo vzorke z hľadiska stupňa ionizácie, zásaditosti alebo kyslosti, z hľadiska molekulovej hmotnosti, polarizovateľnosti a iných parametrov, tým väčšia je pravdepodobnosť rozdielneho separačného mechanizmu takýchto látok. .

V praxi sa najviac rozšírila „reverzná“ (partičná) chromatografia, v ktorej stacionárna fáza nie je polárna, ale mobilná fáza je polárna (t. j. reverzná chromatografia s „priamou fázou“).

Vo väčšine laboratórií na svete sa skupina 16 prioritných PAH analyzuje pomocou HPLC alebo CMS.

KAPITOLA 2. PODSTATA HPLC

Pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC) je povaha procesov prebiehajúcich v chromatografickej kolóne vo všeobecnosti identická s procesmi v plynovej chromatografii. Rozdiel je len v použití kvapaliny ako stacionárnej fázy. Vzhľadom na vysokú hustotu kvapalných mobilných fáz a vysoký odpor kolón sa plynová a kvapalinová chromatografia značne líšia v prístrojovom vybavení.

V HPLC sa ako mobilné fázy zvyčajne používajú čisté rozpúšťadlá alebo ich zmesi.

Na vytvorenie prúdu čistého rozpúšťadla (alebo zmesí rozpúšťadiel), v kvapalinovej chromatografii nazývaného eluent, sa používajú čerpadlá, ktoré sú súčasťou hydraulického systému chromatografu.

Adsorpčná chromatografia sa uskutočňuje ako výsledok interakcie látky s adsorbentmi, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, ktoré majú aktívne centrá na povrchu. Rozdiel v schopnosti interagovať s adsorpčnými centrami rôznych molekúl vzorky vedie k ich separácii do zón v procese pohybu s mobilnou fázou cez kolónu. Dosiahnuté rozdelenie zón komponentov v tomto prípade závisí od interakcie s rozpúšťadlom a adsorbentom.

Silikagélové adsorbenty s rôznymi objemami, povrchmi a priemermi pórov nachádzajú najväčšie uplatnenie v HPLC. Oxid hlinitý a iné adsorbenty sa používajú oveľa menej často. Hlavným dôvodom je:

Nedostatočná mechanická pevnosť, ktorá neumožňuje balenie a použitie pri zvýšených tlakoch typických pre HPLC;

silikagél má v porovnaní s oxidom hlinitým širší rozsah pórovitosti, povrchu a priemeru pórov; výrazne vyššia katalytická aktivita oxidu hlinitého vedie k skresleniu výsledkov analýzy v dôsledku rozkladu zložiek vzorky alebo ich nevratnej chemisorpcie.

HPLC detektory

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa používa na detekciu polárnych neprchavých látok, ktoré sa z nejakého dôvodu nedajú previesť do formy vhodnej pre plynovú chromatografiu ani vo forme derivátov. Medzi takéto látky patria najmä sulfónové kyseliny, vo vode rozpustné farbivá a niektoré pesticídy, ako sú deriváty fenylmočoviny.

Detektory:

UV - diódový detektor poľa. „Matrica“ fotodiód (je ich viac ako dvesto) neustále registruje signály v UV a viditeľnej oblasti spektra, čím zabezpečuje záznam UV-B spektier v režime skenovania. To umožňuje nepretržite zaznamenávať pri vysokej citlivosti neskreslené spektrá komponentov rýchlo prechádzajúcich špeciálnou bunkou.

V porovnaní s detekciou na jednej vlnovej dĺžke, ktorá neposkytuje informáciu o „čistote“ píku, poskytuje možnosť porovnať celé spektrá diódového poľa výsledok identifikácie s oveľa väčšou istotou.

Fluorescenčný detektor. Veľká obľuba fluorescenčných detektorov je spôsobená veľmi vysokou selektivitou a citlivosťou a tým, že mnohé látky znečisťujúce životné prostredie fluoreskujú (napríklad polyaromatické uhľovodíky).

Elektrochemický detektor sa používa na detekciu látok, ktoré sa ľahko oxidujú alebo redukujú: fenoly, merkaptány, amíny, aromatické nitro a halogénderiváty, aldehydy, ketóny, benzidíny.

Chromatografická separácia zmesi na kolóne v dôsledku pomalého postupu PF trvá dlho. Na urýchlenie procesu sa chromatografia uskutočňuje pod tlakom. Táto metóda sa nazýva vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

Modernizácia zariadení používaných v klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografii z nej urobila jednu zo sľubných a moderných metód analýzy. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia je vhodná metóda na separáciu, preparatívnu izoláciu a vykonávanie kvalitatívnej a kvantitatívnej analýzy neprchavých termolabilných zlúčenín s nízkou aj vysokou molekulovou hmotnosťou.

V závislosti od typu použitého sorbentu pri tejto metóde sa používajú 2 varianty chromatografie: na polárnom sorbente s nepolárnym eluentom (možnosť priamej fázy) a na nepolárnom sorbente s použitím polárneho eluentu - tzv. -fázová vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (RPHLC).

Keď eluent prechádza do eluentu, rovnováha v podmienkach RPHLC sa ustanoví mnohonásobne rýchlejšie ako v podmienkach polárnych sorbentov a nevodných PF. V dôsledku toho, ako aj pohodlnosti práce s vodou a voda-alkohol eluentmi, si RPHLC teraz získal veľkú popularitu. Väčšina analýz HPLC sa uskutočňuje pomocou tejto metódy.

Detektory. Registrácia výstupu z kolóny samostatného komponentu sa vykonáva pomocou detektora. Na registráciu môžete využiť zmenu akéhokoľvek analytického signálu prichádzajúceho z mobilnej fázy a súvisiaceho s povahou a množstvom zložky zmesi. Kvapalinová chromatografia využíva také analytické signály, ako je absorpcia svetla alebo svetelná emisia vystupujúceho roztoku (fotometrické a fluorimetrické detektory), index lomu (refraktometrické detektory), potenciál a elektrická vodivosť (elektrochemické detektory) atď.

Priebežne detekovaný signál zaznamenáva rekordér. Chromatogram je sekvencia signálov detektora zaznamenaných na záznamovej páske, generovaných, keď jednotlivé zložky zmesi opúšťajú kolónu. V prípade separácie zmesi sú na vonkajšom chromatograme viditeľné jednotlivé píky. Poloha píku na chromatograme sa používa na účely identifikácie látky, výška alebo plocha píku - na účely kvantitatívneho stanovenia.

2.1 Aplikácia

HPLC nachádza najširšie uplatnenie v nasledujúcich oblastiach chemickej analýzy (zvýraznené sú predmety analýzy, kde HPLC prakticky nemá konkurenciu):

· Kontrola kvality potravín - tonizujúce a chuťové prísady, aldehydy, ketóny, vitamíny, cukry, farbivá, konzervačné látky, hormóny, antibiotiká, triazín, karbamát a iné pesticídy, mykotoxíny, nitrózoamíny, polycyklické aromatické uhľovodíky atď.

· Ochrana životného prostredia - fenoly, organické nitrozlúčeniny, mono- a polycyklické aromatické uhľovodíky, množstvo pesticídov, hlavné anióny a katióny.

· Kriminalistika - drogy, organické výbušniny a farbivá, silné liečivá.

· Farmaceutický priemysel - steroidné hormóny, prakticky všetky produkty organickej syntézy, antibiotiká, polymérne prípravky, vitamíny, proteínové prípravky.

Medicína - uvedené biochemické a liečivé látky a ich metabolity v biologických tekutinách (aminokyseliny, puríny a pyrimidíny, steroidné hormóny, lipidy) pri diagnostike chorôb, určovaní rýchlosti vylučovania liečiv z organizmu za účelom ich individuálneho dávkovania .

· Poľnohospodárstvo - stanovenie dusičnanov a fosforečnanov v pôdach na stanovenie potrebného množstva hnojív, stanovenie nutričnej hodnoty krmív (aminokyseliny a vitamíny), rozbor pesticídov v pôde, vode a poľnohospodárskych produktoch.

Biochémia, bioorganická chémia, genetické inžinierstvo, biotechnológia - cukry, lipidy, steroidy, proteíny, aminokyseliny, nukleozidy a ich deriváty, vitamíny, peptidy, oligonukleotidy, porfyríny atď.

· Organická chémia - všetky stabilné produkty organickej syntézy, farbivá, termolabilné zlúčeniny, neprchavé zlúčeniny; anorganická chémia (prakticky všetky rozpustné zlúčeniny vo forme iónov a komplexných zlúčenín).

· Kontrola kvality a bezpečnosti potravinárskych výrobkov, alkoholických a nealkoholických nápojov, pitnej vody, chemikálií pre domácnosť, parfumov vo všetkých fázach ich výroby;

určenie povahy znečistenia na mieste katastrofy spôsobenej ľudskou činnosťou alebo mimoriadnej udalosti;

detekcia a analýza omamných, silných, jedovatých a výbušných látok;

stanovenie prítomnosti škodlivých látok (polycyklické a iné aromatické uhľovodíky, fenoly, pesticídy, organické farbivá, ióny ťažkých kovov, alkalických kovov a kovov alkalických zemín) v kvapalných odpadoch, emisiách do ovzdušia a tuhých odpadoch z podnikov a v živých organizmoch;

· sledovanie procesov organickej syntézy, spracovania ropy a uhlia, biochemickej a mikrobiologickej výroby;

analýza kvality pôdy na hnojenie, prítomnosť pesticídov a herbicídov v pôde, vode a produktoch, ako aj nutričná hodnota krmív; komplexné výskumné analytické úlohy; získanie mikromnožstva ultračistej látky.

KAPITOLA 3. PRÍKLADY POUŽITIA HPLC PRI ANALÝZE ENVIRONMENTÁLNYCH OBJEKTOV

HPLC - metóda na monitorovanie PAU v objektoch životného prostredia

Pre polycyklické aromatické uhľovodíky (PAH), ekotoxické látky 1. triedy nebezpečnosti, boli stanovené extrémne nízke hladiny maximálnych povolených koncentrácií (MAC) v prírodných objektoch. Stanovenie PAH na úrovni MPC a nižšej je jednou z veľmi zložitých analytických úloh a na ich riešenie sa používajú high-tech analytické metódy (GC-MS, GC, HPLC). Pri výbere metódy na monitorovanie sa okrem hlavných uvažovaných charakteristík - citlivosti a selektivity, expresnosti a hospodárnosti pridávajú, pretože. monitorovanie zahŕňa sériovú analýzu. Variant HPLC na krátkych kolónach malého priemeru tieto požiadavky do značnej miery spĺňa. Pomocou tejto metódy autori vyvinuli a certifikovali metódy monitorovania benzo[a]pyrénu v troch prírodných prostrediach: aerosól, snehová pokrývka a povrchové vody. Metódy sa vyznačujú: jednoduchou unifikovanou prípravou vzorky vrátane extrakcie PAU organickými rozpúšťadlami a zahustením extraktu, priamym zavedením koncentrovaného extraktu do chromatografickej kolóny, využitím viacvlnovej fotometrickej detekcie v UV oblasti spektra, identifikáciou píkov PAH v chromatogramoch s použitím dvoch parametrov, retenčného času a spektrálneho pomeru. Celková chyba pri stanovení benz[a]pyrénu v aerosóle v koncentračnom rozsahu od 0,3 do 450 ng/m až do 50 μg/m 2 nepresahuje 10 %. Pre prípad súčasného stanovenia prioritných PAH (do 12 zlúčenín) a registrácie nehomogénnych píkov analytov bolo navrhnuté znovu separovať extrakt so zmenou selektivity mobilnej fázy, vlnovej dĺžky detekcie a teploty kolóny, berúc do úvahy jednotlivé vlastnosti stanovovaných PAU.

1 . Kvalita okolitého vzduchu. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. Postup vykonávania meraní metódou HPLC. Osvedčenie o atestácii MVI č. 01-2000.

2 . Kvalita povrchových a čistených odpadových vôd. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. Postup vykonávania meraní metódou HPLC. Osvedčenie o atestácii MVI č. 01-2001.

3 . Kvalita snehovej pokrývky. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. Postup vykonávania meraní metódou HPLC. Osvedčenie o atestácii MVI č. 02-2001.

Odstránenie anilínu z vodných roztokov pomocou odpadov z aluminotermickej obnovy valcovaného medeného kameňa

Problém odstraňovania uhľovodíkov z odpadových vôd je naliehavou úlohou. V mnohých chemických, petrochemických a iných priemyselných odvetviach vzniká anilín a jeho deriváty, čo sú toxické látky. Anilín je vysoko toxická látka, MPC - 0,1 mg/m3. Anilín a jeho deriváty sú rozpustné vo vode, a preto ich nemožno odstrániť gravitačným usadzovaním.

Jednou z najlepších metód čistenia odpadových vôd od organických polutantov je použitie anorganických a organických adsorbentov schopných regenerácie (hlinitosilikáty, modifikované íly, drevo, vlákna a pod.) a neschopných regenerácie (aktívne uhlie, makroporézne polymérne materiály a pod.) .).

Regenerované adsorbenty dokážu z vody odstrániť organické látky rôznej polarity. Hľadanie účinných adsorbentov je naliehavou úlohou.

V tejto správe sú prezentované výsledky štúdie v oblasti použitia medených okují z Jerevanskej káblovky (OPMOERKZ) ako anilínových sorbentov.

Chromatografické štúdie sa uskutočnili na HPLC chromatografe / vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii / systémoch (Waters 486 - detektor, Waters 600S - kontrolér, Waters 626 - Pump), na kolóne 250 x 4 mm naplnenej skúmanými sorbentmi, rýchlosť mobilnej fázy 1 ml/m / mobilná fáza sú rozpúšťadlá, ktoré študujeme/, detektor je UV-254. UV spektroskopická analýza sa uskutočnila na spektrofotometri Specord-50, spektrá sa získali pomocou počítačového programu ASPECT PLUS.

K určitým objemom anilínu vo vode sa pridávali presne odvážené dávky sorbentov, ktorých počiatočné koncentrácie sa menili. Zmes sa dôkladne pretrepáva 6 hodín a potom sa vzorka nechá usadiť. Adsorpcia je ukončená za takmer 48 hodín Množstvo vyzrážaného anilínu bolo stanovené UV spektrofotometrickou, ako aj refrakčnou analýzou.

Najprv sa študovali adsorpčné vlastnosti OPMOEPKZ pri odstraňovaní anilínu z roztoku v tetrachlórmetáne. Ukázalo sa, že anilín najlepšie absorbuje sorbent 3 (tabuľka).

Merania sa uskutočňovali aj pre vodné roztoky anilínu v koncentráciách 0,01-0,0001 mol/l. V tabuľke sú uvedené údaje o 0,01 M roztoku.

Absorpcia anilínu rôznymi sorbentmi z 0,01 M vodného roztoku anilínu pri 20°C

Predtým sa zistilo, že adsorpcia v rámci uvedených koncentračných rozsahov sa zvyšuje a lineárne závisí od indexu lomu. Množstvo anilínu sa určilo z grafu indexu lomu proti molárnej koncentrácii a korigovalo sa pre kvapalinovú chromatografiu aj UV spektrálnu analýzu.

Pre vodné roztoky je najaktívnejší sorbent 3. Množstvo adsorbovanej škodliviny bolo vypočítané ako rozdiel medzi celkovým množstvom znečisťujúcej látky pridanej do pôvodného roztoku a jej zvyškom v konečnom roztoku.

Metódy stanovenia PAU v objektoch životného prostredia

Na stanovenie PAH sa zvyčajne používajú metódy plynovej chromatografie (GC) a vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). separácia hlavných 16 PAH postačujúca na kvantitatívnu analýzu sa dosiahne buď pomocou kapilárnych kolón v plynovej chromatografii, alebo pomocou vysokovýkonných kolón používaných v HPLC. Treba mať na pamäti, že kolóna, ktorá dobre separuje kalibračné zmesi šestnástich PAH, nezaručuje, že budú dobre separované aj na pozadí sprievodných organických zlúčenín v skúmaných vzorkách.

V záujme zjednodušenia analýzy, ako aj dosiahnutia vysokej kvality získaných výsledkov väčšina analytických postupov obsahuje štádium predbežnej izolácie (separácie) PAU od ostatných skupín príbuzných zlúčenín vo vzorkách. Najbežnejšie metódy používané na tento účel sú nízkotlaková kvapalinová chromatografia v systémoch kvapalina-pevná látka alebo kvapalina-kvapalina využívajúca adsorpčné mechanizmy, ako je použitie silikagélu alebo oxidu hlinitého, niekedy sa používajú zmiešané mechanizmy, ako je adsorpcia a vylúčenie pomocou Sephadexu.

Použitie predbežnej úpravy vzoriek umožňuje vyhnúť sa vplyvu:

Úplne nepolárne zlúčeniny, ako sú alifatické uhľovodíky;

Stredne a silne polárne zlúčeniny, napríklad ftalán, fenoly, viacsýtne alkoholy, kyseliny;

Vysokomolekulárne zlúčeniny, ako sú napríklad živice.

Vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC) sa používajú hlavne dva typy detektorov: fluorimetrický detektor alebo spektrofotometrický detektor s fotodiódovou tyčou. Limit detekcie PAH pri fluorimetrickej detekcii je veľmi nízky, čo robí túto metódu obzvlášť vhodnou na stanovenie stopových množstiev polyaromatických zlúčenín. Klasické fluorimetrické detektory však neposkytujú prakticky žiadne informácie o štruktúre skúmanej zlúčeniny. Moderné konštrukcie umožňujú zaznamenať fluorescenčné spektrá, ktoré sú charakteristické pre jednotlivé zlúčeniny, no v praxi rutinných meraní sa zatiaľ nerozšírili. Spektrofotometrický detektor s fotodiódovou čiarou (PDL) umožňuje zaznamenávať absorpčné spektrá v UV a viditeľnom spektrálnom rozsahu, tieto spektrá je možné použiť na identifikáciu. Podobné informácie možno získať pomocou detektorov rýchleho skenovania.

Pri výbere analytickej techniky na separáciu, identifikáciu a kvantifikáciu týchto PAH je potrebné vziať do úvahy tieto podmienky:

Úroveň stanovených obsahov v študovaných vzorkách;

Počet príbuzných látok;

Použitý analytický postup (technika merania);

Možnosti sériového vybavenia.

Vývoj metódy na stanovenie prvkov alkalických zemín a horčíka pomocou iónovej vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie

Vývoj a zdokonaľovanie metód, ktoré umožňujú riešiť problémy analýzy vody, je dôležitým problémom analytickej chémie. Rozvoj vysokoúčinnej vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie podnietil vývoj nového smeru v iónovo-výmennej chromatografii, takzvanej iónovej chromatografii. Syntéza sorbentov pre iónovú chromatografiu je náročná, pretože sú na ne kladené pomerne veľké požiadavky. Kvôli nedostatku komerčne dostupných vysokovýkonných katexov bola použitá dynamicky modifikovaná reverzná fáza, pre ktorú bol syntetizovaný modifikátor: kyselina N-hexadecyl-N-dekanoyl-para-amino-benoylsulfónová etyl-diizopropylamónium (DGDASC), kde hydrofóbny amín obsahujúci skupinu S03-, schopný výmeny katiónov. Po prechode roztokom modifikátora dosiahla absorpcia pri l = 260 nm 6,4 jednotiek optickej hustoty (°E) a dosiahla plató. Vypočítaná kapacita výmeny iónov je 15,65 µmol. Keďže katióny prvkov alkalických zemín a horčíka neabsorbujú v UV oblasti spektra, bola použitá nepriama UV detekcia s použitím syntetizovaného UV absorbujúceho eluentu 1,4-dipyridíniumbutánbromidu (DPB bromid). Pretože halogénové ióny ničia oceľové časti kolóny, bol bromidový ión 1,4-dipyridíniumbutánu nahradený acetátovým iónom. Keď sa kolóna premyje eluentom, protiión modifikátora, etyldiizopropylamónium, sa nahradí UV-absorbujúcim iónom 1,4-dipyridíniumbutánom. Separácia katiónov bola uskutočnená pri optimálnej vlnovej dĺžke l = 260 nm na stupnici 0,4 A v režime „skladanie mierky“; polarita rekordéra bola obrátená. Separácia všetkých študovaných katiónov bola dosiahnutá zavedením komplexotvornej prísady - kyseliny šťaveľovej. Detekčné limity Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ sú 8 μg/l; 16 ug/l; 34 ug/l; 72 µg/l. Za zvolených podmienok bola analyzovaná voda z vodovodu, v ktorej je obsah Ca 2+ 10,6 + 1,9 mg-ión/l, Mg 2+ -2,5 + mg-ión/l. Chyba reprodukovateľnosti nepresahuje -2,2 % pre Ca2+ a 1,4 % pre Mg2+.

Analýza komplexov kadmia v životnom prostredí

Na štúdium mechanizmov migrácie ťažkých kovov v biosfére sú potrebné údaje o chemických formách existencie kovov v prírode. Ťažkosti pri analýze zlúčenín jedného z najtoxickejších kovov – kadmia – sú spojené s tým, že tvorí nestabilné komplexy a pri pokuse o ich izoláciu dochádza k narušeniu prirodzenej rovnováhy. V tejto práci boli zlúčeniny kadmia v pôde a rastlinách študované pomocou techniky založenej na chromatografickej separácii extraktov s následnou identifikáciou zložiek chemickou analýzou. Tento prístup umožnil nielen identifikovať chemické formy kadmia, ale aj sledovať ich premeny v objektoch životného prostredia.

OH-skupiny sacharidov a polyfenolov (vrátane flavonoidov), C=O, fosfáty, NH 2, NO 2, SH-skupiny sú koordinované s kadmiom v biosférických objektoch. Na účely tejto štúdie bol zostavený súbor modelových ligandov reprezentujúcich tieto triedy zlúčenín. Interakcia modelových ligandov s vo vode rozpustnými soľami kadmia bola študovaná UV spektroskopiou a HPLC.

Na izoláciu zlúčenín kadmia bola použitá extrakcia špeciálne vybranými (netvoriacimi komplexy s Cd) rozpúšťadlami. Týmto spôsobom možno kadmium oddeliť od všetkých ťažkých kovov, okrem jeho blízkeho chemického analógu, zinku. Píky obsahujúce kadmium a zinok v chromatogramoch získaných extraktov boli detekované väzbou kovov vo forme ich ditizonátov. Na oddelenie od zinku sa použil rozdiel v stabilite komplexov Cd a Zn pri pH 6–8. Izolované Cd zlúčeniny sa identifikovali pomocou HPLC so zmenami pH počas elúcie. Bola vykonaná analýza zlúčenín kadmia s pôdnymi zložkami a rastlinnými pletivami a identifikované látky produkované rastlinami v reakcii na zvýšený príjem kadmia z pôdy. Ukázalo sa, že flavonoidy, najmä tricín, sú ochrannými látkami v obilninách, alkoxyderiváty cysteínu v strukovinách a ako polyfenoly, tak tioly v krížových rastlinách.

KAPITOLA 4. VYBAVENIE HPLC

SÉRIA ACCELA

Nový ultra vysokovýkonný kvapalinový chromatograf ACCELA je schopný pracovať v širokom rozsahu prietokov a tlakov a poskytuje tak typické HPLC separácie na konvenčných kolónach, ako aj ultra rýchle a efektívne separácie na kolónach s veľkosťou častíc sorbentu menšou ako 2 µm pri ultravysoké tlaky (viac ako 1000 atm.).

Systém obsahuje inertné čerpadlo s kvartérnym gradientom schopné dodávať tlaky presahujúce 1000 atm a s objemom oneskorenia iba 65 µl, čo poskytuje vysokorýchlostné chromatografické separácie. Autosampler ACCELA schopný pracovať v cykle vstrekovania vzorky 30 sekúnd a poskytuje najvyššiu reprodukovateľnosť vstrekovania. Detektor diódového poľa Accela PDA s minimalizovaným objemom prietokovej kyvety (2 µl) je optimalizovaný pre vysokorýchlostnú chromatografiu, využíva patentovanú technológiu LightPipe a zachováva si symetrický tvar piku, ktorý prichádza s bezchybným chromatografickým systémom a kolónami.

Systém sa perfektne spáruje s hmotnostnými spektrometrami a vytvára najvýkonnejšie a najlepšie LC/MS systémy dostupné na svete.

1,9 µm UHP kolóny dostupné od Thermo Electron pre všetky aplikácie

SÉRIA TSP

Modulárny princíp konštrukcie HPLC prístrojov umožňuje zákazníkovi flexibilne dopĺňať zariadenie na riešenie akýchkoľvek analytických problémov a pri ich zmene je rýchlo a ekonomicky upraviteľné. Široká škála modulov zahŕňa čerpadlá od izokratického až po kvartérny gradient, od mikrokolónových až po semipreparatívne, všetky dostupné detektory, systémy vstrekovania vzoriek od manuálnych injektorov až po autosamplery so schopnosťou manipulovať s akoukoľvek vzorkou, výkonný softvér na spracovanie výsledkov meraní a správu všetky moduly systému. Všetky moduly sú certifikované podľa CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, sú kompaktné, majú moderný dizajn, ľahko sa ovládajú, sú vybavené vstavaným displejom a samo- diagnostický systém, umožňujú vytvárať a ukladať metódy úloh do parametrov pamäte. Spĺňajú kritériá "Exemplary Laboratory Practice" (SLP) a sú uvedené v Registri meracích prístrojov Ruskej federácie. Protokoly merania sa vydávajú v súlade s liekopismi Anglicka, USA, Nemecka a Francúzska.

Modulárne systémy TSP sa vyznačujú najvyššou spoľahlivosťou a stabilitou v prevádzke.

Kombinácia modulov poskytuje analytikovi všetky výhody integrovaného systému na jednej strane a flexibilitu modulárneho systému na strane druhej. Bez ohľadu na oblasť použitia vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) - farmakológia, biotechnológia, environmentálna analýza, klinická analýza, analýza potravín a nápojov, petrochemická a chemická analýza - tento prístroj je vždy optimálne nakonfigurovaný tak, aby spĺňal najvyššie požiadavky .

Výskumné aj vysokovýkonné rutinné systémy poskytujú:

Vysoko účinné odplynenie rozpúšťadla

Schopnosť pracovať s malým a ultra malým množstvom vzoriek

Najvyššia citlivosť, s UV/VIS detektorom aj diódovým poľom (so známou technológiou LightPipe s možnosťou výberu dĺžky optickej dráhy 1 alebo 5 cm)

Práca s rôznymi stĺpcami

Najvyššia kvantitatívna presnosť

Možnosť automatickej práce s rôznymi objemami vzoriek

Chyba retenčného času RMS menšia ako 0,3 %

Minimálna pracovná plocha, ktorú systém zaberá

Najvyššia spoľahlivosť a stabilita parametrov.

Surveyor LC Pump- HPLC pumpa s najlepšou reprodukovateľnosťou retenčného času zo všetkých 4-zložkových gradientových pump dostupných na svete. Integrovaný štvorkanálový vákuový odplyňovač a tlmič pulzácií poskytujú vynikajúcu základnú stabilitu pre maximálnu citlivosť a presnosť kvantifikácie.

Autosampler poskytuje najvyšší výkon a flexibilitu analýzy. Široká škála podnosov na vzorky, od štandardných liekoviek až po 96- a 384-jamkové mikrodoštičky, pokrýva potreby prakticky všetkých aplikácií. Nová technológia neposkytuje prakticky žiadnu stratu vstrekovania vzorky, prakticky 5 µl vzorky sa vstrekuje pomocou automatického vzorkovača z celkového objemu vzorky 5 µl.

SURVEYOR

UV/vizuálny detektor a PDA (detektor diódového poľa)

Surveyor UV/Vis- detektor ultrafialového a viditeľného svetla s premenlivou vlnovou dĺžkou je kombináciou hospodárnosti a spoľahlivosti s najvyššou citlivosťou technológie LightPipe. Široký výber prietokových komôr robí tento detektor všestranným pre všetky aplikácie od tých, ktoré používajú kapilárnu alebo mikrokolónovú chromatografiu, až po semipreparatívnu a preparatívnu.

Surveyor PDA Detektor je najcitlivejší spomedzi všetkých HPLC diódových detektorov. Dvojlampová zdrojová optika bezproblémovo pokrýva celý rozsah vlnových dĺžok od 190 do 800 nm. Formovač lúča z optických vlákien poskytuje vynikajúce optické rozlíšenie bez obetovania citlivosti.

Geodet RI refraktometrický detektor s minimálnym objemom termostatovaná kyveta s plne elektronickým ovládaním z počítača.

Geodet FL fluorometrický skenovací detektor s najvyššou citlivosťou a detekčnou schopnosťou pre fluorescenciu, chemiluminiscenciu a fosforescenciu.

Široká škála autosamplerov vám umožňuje pracovať s konvenčnými liekovkami a 96-polohovými doštičkami, ktoré sa široko používajú v biochémii a klinickej praxi. Manipuláciu uľahčuje použitie podobných doštičiek na prípravu vzoriek SPE.

400 Elektrický pohon, slučka Valco (20 µl - štandard) s možnosťou čiastočného plnenia.

Kolotoč 96 vzoriek.

Elektrický pohon, stĺpcový termostat, slučka Valco (100 µl - štandard) s možnosťou čiastočného plnenia.Režim AutoMix na prípravu vzorky. Kolotoč na vzorky: 84 x 2 ml (vzorky) + 3 x 10 ml (reagencie). Vstavaný stĺpový termostat. 420

Slučkový autosampler pre výskumnú prácu s možnosťou práce v režimoch úplného, čiastočného plnenia a zavádzania mikrolitrových vzoriek. Široká ponuka kolotočov (štandard - 96 vzoriek).

Tabletový autosampler pre doštičky s 96 a 384 polohami. Vstrekovanie vzorky do tlakovej slučky, možnosť zavedenia vzoriek menších ako 1 µl. Možnosť inštalácie podávača tabletu. HPLC

Významní výrobcovia zariadení HPLC

· Waters - vysokoúčinná chromatografia, hmotnostná spektrometria, kolóny, extrakcia na pevnej fáze;

Varian, Inc. - chromatografy a kolóny, príslušenstvo na extrakciu tuhou fázou;

· Agilent Technologies - chromatografy a kolóny;

· Hypersil - kolóny a sorbenty.

· Merck KGaA - TLC platne a príslušenstvo pre TLC, kolóny, sorbenty, mobilné fázy pre HPLC, príslušenstvo pre extrakciu tuhou fázou

· Dionex - zariadenia a kolóny pre HPLC, najmä pre iónovú chromatografiu.

Literatúra

1.Pilipenko A.T., Pjatnický I.V. Analytická chémia. V dvoch knihách: kn..1 - M .: Chemistry, 1990, -480s.

1. Pilipenko A.T., Pjatnický I.V. Analytická chémia. V dvoch knihách: kn..2 - M .: Chemistry, 1990, -480s.

2. Vasiliev V.P. Analytická chémia. O 14.00 hod. Časť 2. Fyzikálne a chemické metódy analýzy: Proc. pre Khimko - technol. špecialista. univerzity. - M .: Vyššie. škola, 1989. - 384s.

3. Hydrochemické materiály. Ročník 100. Metódy a technické prostriedky prevádzkového monitorovania kvality povrchových vôd. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. - 200s.

4. Lurie Yu.Yu. Analytická chémia priemyselných odpadových vôd / Yu.Yu. Lurie; M.: Chemistry Yu, 1984. - 448s.

5. Ewing G. Inštrumentálne metódy chemickej analýzy / Per. z angličtiny. M.: Mir, 1989. - 348 s.

6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Monitorovanie životného prostredia. V 2 zväzkoch Petrohrad: Vianoce. 2000. - 260 s.

7. Aivazov B.V. Úvod do chromatografie. M.: Vyššie. škola, 1983. - 450 s.

8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Úvod do plynovej chromatografie. M.: Chémia, 1990. - 329 s.

9. Stolyarov B.V. a iné // Praktická plynová a kvapalinová chromatografia. Petrohrad: Petrohradská štátna univerzita, 1998. - S. 81.

11. Gorshkov A.G., Marinait I.I. HPLC - metóda na monitorovanie PAU v objektoch životného prostredia

12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O. Odstránenie anilínu z vodných roztokov pomocou odpadových produktov aluminotermickej redukcie kotevných medených okují

13. L.A. Turkina, G.N. Koroleva Vývoj metódy na stanovenie prvkov alkalických zemín a horčíka pomocou iónovej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie

14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Analýza komplexov kadmia v životnom prostredí

Dodatok

STANOVENIE KLOMAZÓNU VO VODE CHROMATOGRAFICKÝMI METÓDAMI

METODICKÉ POKYNY MUK 4.1.1415-03

1. Vypracovalo: Federálne vedecké centrum pre hygienu. F.F.

Erisman; Moskovská poľnohospodárska akadémia. K.A.

Timiryazev; za účasti oddelenia štátneho sanitárneho a epidemiologického dohľadu Ministerstva zdravotníctva Ruska. Vývojári metodiky sú uvedení na konci.

3. Schvaľuje hlavný štátny sanitár

Ruskej federácie, prvý námestník ministra zdravotníctva Ruskej federácie, akad. RAMS G.G. Oniščenko 24. júna 2003

5. Prvýkrát predstavený.

1. Úvod

Výrobca: FMS (USA).

Obchodné meno: COMMAND.

Účinná látka: klomazon.

2-(2-chlórbenzyl)-4,4-dimetyl-3-izoxalidín-3-ón (IUPAC)

Svetlohnedá viskózna kvapalina.

Teplota topenia: 25 °C.

Teplota varu: 275 °C.

Tlak pár pri 25 °C: 19,2 MPa.

Rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda: K logP = 2,5.

Dobre rozpustný v acetóne, hexáne, etanole, metanole,

chloroform, dichlórmetán a acetonitril; rozpustnosť vo vode -

1,10 g/cu. dm. Stabilný pri izbovej teplote najmenej 2 roky, pri 50 -C - najmenej 3 mesiace.

Stručný toxikologický profil: Akútne orálne

toxicita (LD) pre potkany - 1369 - 2077 mg/kg; akútna dermálna

toxicita (LD) pre potkany - viac ako 2000 mg/kg; akútna

inhalačná toxicita (LC) pre potkany - 4,8 mg / cu. dm (4 hodiny).

Hygienické normy. MPC vo vode - 0,02 mg / cu. dm.

Rozsah lieku. Clomazone je selektívny herbicíd používaný na ničenie obilnín a dvojklíčnolistových burín v plodinách sóje a ryže počas preemergentnej alebo predsejbovej aplikácie.

2. Metóda stanovenia clomazonu vo vode

chromatografické metódy

2.1. Kľúčové body

2.1.1. Princíp techniky

Technika je založená na extrakcii clomazonu z analyzovanej vzorky hexánom, zahustení extraktu a následnom kvantitatívnom stanovení alternatívnymi metódami:

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) s

ultrafialovým detektorom, plynovou kvapalinovou chromatografiou (GLC) s detektorom konštantnej rýchlosti rekombinácie alebo chromatografiou na tenkej vrstve (TLC). Kvantitatívne stanovenie sa vykonáva metódou absolútnej kalibrácie.

2.1.2. Selektivita metódy

Metóda je v navrhnutých podmienkach špecifická v prítomnosti globálnych environmentálnych polutantov: chlórových derivátov cykloparafínov (HCH izoméry), difenylových zlúčenín (DDT a jeho deriváty), ich metabolitov - polychlórovaných benzénov a fenolov, ako aj v prítomnosti trichlóracetát sodný, ktorý možno použiť na plodiny ako herbicíd.

2.1.3. Metrologická charakteristika metódy (P = 0,95)

Činidlá, roztoky a materiály

Clomazone s obsahom d. 99,8 %

(FMS, USA)

Dusík, alebo GOST 9293-79

Vodný amoniak, 25%, h GOST 1277-81

Acetón, h GOST 2603-79

n-Hexán, h GOST 2603-79

Peroxid vodíka, 30% vodný roztok GOST 10929-77

Izopropylalkohol, chemicky čistý TU 6-09-402-75

Kyselina sírová, chemicky čistá GOST 4203-77

Kyselina chlorovodíková (chlorovodíková), chemicky čistá GOST 3118-77

Metylalkohol, chemicky čistý GOST

Hydroxid sodný, chemicky čistý, 25% vodný roztok GOST 4323-77

Bezvodý síran sodný, chemicky čistý GOST 1277-81

Dusičnan strieborný, chemicky čistý GOST 1277-81

2-Fenoxymetanol, h TU 6-09-3688-76

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 – 0,20 mm)

s 5 % SE-30, Hemapol, Česká republika

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) s 1,5

OV-17 + 1,95 % QF-1, Hemapol, Česká republika

Doštičky pre HPTLC (ZSSR)

Records "Kieselgel 60 F-254" (Nemecko)

Rekordy "Silufol" Česká republika

Papierové filtre "biela páska", bez popola a predprané hexánom TU 6-09-2678-77

2.3. Príbory, vybavenie, riad

Kvapalinový chromatograf Milichrome

s UV detektorom

Chromatografický oceľový stĺpec,

dĺžka 64 mm, vnútorný priemer 2 mm,

plnené Silasorbom 600, zrnitosť 5 µm

Plynový chromatograf radu "Farebný" príp

podobné, vybavené konštantným detektorom

rýchlosť rekombinácie (RPR) s limitom

detekcia lindanom 4 x 10 g/cu. cm

Chromatografický sklenený stĺpec, dĺžka

1 alebo 2 m, vnútorný priemer 2 - 3 mm

Mikrostriekačka typ MSH-10, objem 10 µl TU 5E2-833-024

Zariadenie na trepanie typu AVU-6s TU 64-1-2851-78

Vodný kúpeľ TU 64-1-2850-76

Analytické váhy typu VLA-200 GOST 34104-80E

Chromatografická komora GOST 10565-74

Vodné prúdové čerpadlo GOST 10696-75

Ortuťovo-kremenný žiarič typ OKN-11 TU 64-1-1618-77

Sklenené striekacie pištole GOST 10391-74

Rotačná vákuová odparka IR-1M

alebo podobný TU 25-11-917-76

Kompresorová jednotka TU 64-1-2985-78

Sušiaca skriňa TU 64-1-1411-76E

Deliace lieviky GOST 3613-75

Odmerné banky s objemom 100 ml GOST 1770-74

Odmerné valce s objemom 10, 50 ml GOST 1770-74E

Banky hruškovitého tvaru s tenkou časťou,

s kapacitou 100 ml GOST 10394-72

Banky kónické, s objemom 100 ml GOST 22524-77

Odstredivé skúmavky, merané podľa GOST 25336-82E

Pipety, s kapacitou 0,1, 1, 2, 5 a 10 ml GOST 20292-74

Chemické lieviky, kužeľové, priem

34 - 40 mm GOST 25336-82E

2.4. Výber vzorky

Odber vzoriek, skladovanie a príprava vzoriek sa vykonáva v súlade s

"Jednotné pravidlá pre odber vzoriek poľnohospodárskych produktov, potravín a predmetov životného prostredia na stanovenie stopových množstiev pesticídov", schválené pre N 2051-79 z 21.08.79

Odobraté vzorky je možné uchovávať v chladničke až 5 dní. Pred analýzou sa voda (v prítomnosti suspenzie) prefiltruje cez voľný papierový filter.

2.5. Príprava na definíciu

2.5.1. HPLC metóda

2.5.1.1. Príprava mobilnej fázy pre HPLC

Do odmernej banky s objemom 100 ml sa pipetou vloží 5 ml izopopanolu a 5 ml metanolu, doplní sa po značku hexánom, premieša sa, prefiltruje.

2.5.1.2. Kondicionovanie stĺpcov

Premývajte HPLC kolónu zmesou hexán-metanol-izopropanol (90:5:5, obj./obj.) počas 30 minút. pri rýchlosti dávkovania rozpúšťadla 100 ul/min.

2.5.2. GLC metóda. Príprava a kondicionovanie kolóny

Hotová náplň (5 % SE-30 na Chromaton N-AW-DMCS) sa naleje do sklenenej kolóny, zhutní sa vo vákuu, kolóna sa inštaluje do termostatu chromatografu bez pripojenia k detektoru a stabilizuje sa v prúde dusíka pri teplota 250 -C počas 10 - 12 hod

2.5.3. TLC metóda

2.5.3.1. Príprava vyvíjacích činidiel

2.5.3.1.1. Vyvolávacie činidlo č. 1

1 g dusičnanu strieborného sa rozpustí v 1 ml destilovanej vody, pridá sa 10 ml 2-fenoxymetanolu, 190 ml acetónu, 1-2 kvapky peroxidu vodíka, roztok sa premieša a prenesie do fľaše z tmavého skla.

2.5.3.2.2. Vyvolávacie činidlo N2

V 100 ml odmernej banke sa rozpustí 0,5 g dusičnanu strieborného v 5 ml destilovanej vody, pridá sa 10 ml 25 % vodného amoniaku, roztok sa upraví na 100 ml acetónom, premieša sa a prenesie do fľaše z tmavého skla.

2.5.3.2. Príprava mobilnej fázy na TLC

Do odmernej banky s objemom 100 ml pridajte 20 ml acetónu a pridajte hexán po značku, premiešajte. Zmes sa naleje do chromatografickej komory s vrstvou nie väčšou ako 6 - 8 mm za 30 minút. Pred začatím chromatografie.

2.5.4. Príprava štandardných roztokov

Zásobný štandardný roztok klomazónu s koncentráciou 100 ug/ml sa pripraví rozpustením 0,010 g prípravku obsahujúceho 99,8 % AI v hexáne v 100 ml odmernej banke. Roztok sa uchováva v chladničke mesiac.

Pracovné štandardné roztoky s koncentráciou 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; 20 a 40,0 ug/ml sa pripraví zo zásobného štandardného roztoku clomazonu vhodnými sériovými riedeniami hexánom.

Pracovné roztoky sa uchovávajú v chladničke nie dlhšie ako mesiac.

2.5.5. Zostrojenie kalibračného grafu

2.5.5.1. Kalibračná krivka A (meranie podľa bodu 2.7.1, HPLC)

Na vytvorenie kalibračného grafu sa do injektora chromatografu vstrekne 5 ul pracovného štandardného roztoku klomazónu s koncentráciou 4,0; 10,0; 20,0 a 40 ug/ml.

2.5.5.2. Kalibračná krivka B (meranie podľa bodu 2.7.2, GLC)

Na zostavenie kalibračného grafu sa do odparky chromatografu vstrekne 5 ul pracovného štandardného roztoku klomazónu s koncentráciou 0,4; 1,0; 2,0; 4.0 a 10.0.

Vykonajte aspoň 5 paralelných meraní. Nájdite priemernú výšku chromatografického píku pre každú koncentráciu. Zostrojte kalibračný graf (A alebo B) závislosti výšky chromatografického píku v mm od koncentrácie klomazónu v roztoku v µg/ml.

2.6. Popis definície

100 ml vzorky vody, ktorá sa má analyzovať, sa umiestni do oddeľovacieho lievika s objemom 250 ml, pridá sa 10 ml 25 % vodného roztoku hydroxidu sodného, premieša sa a pridá sa 20 ml n-hexánu. Lievik sa pretrepáva 3 minúty, po oddelení fáz sa hexánová vrstva naleje do hruškovitej banky s objemom 100 ml a nechá sa prejsť cez vrstvu bezvodého síranu sodného umiestnenú v kónickom lieviku na skladanom filtračnom papieri. Extrakcia liečiva z vodnej vzorky sa opakuje ešte dvakrát s použitím 20 ml n-hexánu. Spojený hexánový extrakt sa odparí na rotačnej vákuovej odparke pri teplote 40 -C takmer do sucha, zvyšok sa odfúkne prúdom vzduchu alebo dusíka špeciálnej čistoty. Suchý zvyšok sa rozpustí v 0,1 ml (HPLC, TLC) alebo 0,25 ml (GLC) n-hexánu a analyzuje sa jednou z chromatografických metód.

2.7. Chromatografické podmienky

Kvapalinový chromatograf s ultrafialovým detektorom Milichrom (Rusko).

Oceľový stĺp dĺžka 64 mm, vnútorný priemer 2 mm,

plnené Silasorbom 600, zrnitosť 5 mikrónov.

Teplota kolóny: izbová.

Mobilná fáza: hexán-izopropanol-metanol (90:5:5, obj./obj.).

Prietok eluentu: 100 ul/min.

Pracovná vlnová dĺžka: 240 nm.

Citlivosť: 0,4 jednotky absorpcia na stupnici.

Injekčný objem: 5 ul.

Čas výstupu Clomazone: asi 6 min.

Lineárny rozsah detekcie: 20 - 200 ng.

Vzorky produkujúce píky väčšie ako 40 ug/ml štandardného roztoku sa zriedia mobilnou fázou HPLC.

Plynový chromatograf "Tsvet-570" s detektorom konštantnej rýchlosti rekombinácie iónov.

Sklenená kolóna s dĺžkou 1 m, vnútorným priemerom 3 mm, naplnená Chromatonom N-AW-DMCS s 5 % SE-30 (0,16 - 0,20 mm).

Pracovná stupnica elektromera je 64 x 10 10 Ohm.

Rýchlosť nahrávacej pásky 200 mm/h.

Teplota stĺpcového termostatu - 190 -С

detektor - 300 -C

výparník - 220 -C

Rýchlosť nosného plynu (dusík) - 60 ml / min.

Objem vstreknutej vzorky je 5 µl.

Výstupný čas clomazonu je 2,5 minúty.

Lineárny rozsah detekcie: 2 - 50 ng.

Vzorky, ktoré produkujú píky väčšie ako 10 ug/ml štandardného roztoku, sa zriedia hexánom.

Na zlepšenie presnosti identifikácie klomazónu v prítomnosti gama-HCCH s krátkym retenčným časom vo vzorke sa klomazón zo vzorky odstráni pôsobením koncentrovanej kyseliny sírovej. Opätovná analýza vzorky vám umožňuje stanoviť príspevok klomazónu k primárnemu chromatografickému signálu.

Roztok hexánu v banke získaný podľa bodu 2.6 kvantitatívne

(alebo jeho alikvot) sa aplikuje na chromatografické platne "Silufol", "Kieselgel 60F-254" alebo "Plates for HPTLC". Neďaleko sa aplikujú štandardné roztoky v objeme zodpovedajúcom obsahu klomazónu 1, 2, 5 a 10 μg. Platňa sa umiestni do chromatografickej komory obsahujúcej zmes n-hexán-acetón (4:1, obj./obj.). Po vyvolaní chromatogramu sa platňa vyberie z komory, umiestni sa pod prievan, kým sa rozpúšťadlá neodparia, potom sa spracuje s jedným z vyvolávacích činidiel a umiestni sa pod ultrafialovú lampu na 5 minút. Lokalizačná zóna liečiva na platniach "Silufol", "Plates for HPTLC" a "Kieselgel 60F-254" sa javí ako šedo-hnedé škvrny s hodnotami Rf 0,35, 0,85 a 0,43. Na stanovenie clomazonu pomocou TLC môžete použiť platne "Alugram" a "Polygram" (vyrobené Nemeckom). Hodnota Rf klomazónu na týchto platniach je 0,37 a 0,38.

3. Bezpečnostné požiadavky

Pri práci s organickými rozpúšťadlami, toxickými látkami, elektrickými ohrievačmi je potrebné dodržiavať všeobecne uznávané bezpečnostné pravidlá.

4. Kontrola chyby merania

Prevádzková kontrola chyby a reprodukovateľnosti meraní sa vykonáva v súlade s odporúčaniami MI 2335-95. GSI "Interná kontrola kvality výsledkov kvantitatívnej chemickej analýzy".

5. Vývojári

Yudina T.V., Fedorová N.E. (FNTSG pomenovaná po F.F. Erismanovi).

Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kyjev); Kisenko M.A., Demčenko V.F. (Ústav pracovného lekárstva Akadémie vied a Akadémie lekárskych vied Ukrajiny, Kyjev).

Kvapalinová adsorpčná chromatografia na kolóne

K separácii zmesi látok v adsorpčnej kolóne dochádza v dôsledku ich rozdielnej vstrebateľnosti na danom adsorbente (v súlade so zákonom o adsorpčnej substitúcii, ktorý stanovil M. S. Tsvet).

Adsorbenty sú porézne telesá s vysoko vyvinutým vnútorným povrchom, ktoré zadržiavajú kvapaliny prostredníctvom medzimolekulových a povrchových javov. Môžu to byť polárne a nepolárne anorganické a organické zlúčeniny. Medzi polárne adsorbenty patrí silikagél (sušený želatínový oxid kremičitý), oxid hlinitý, uhličitan vápenatý, celulóza, škrob atď. Nepolárne sorbenty – aktívne uhlie, kaučukový prášok a mnohé iné synteticky získané.

Adsorbenty podliehajú nasledujúcim požiadavkám: S nesmú vstúpiť do chemických reakcií s mobilnou fázou a látkami, ktoré sa majú oddeliť; S musí mať mechanickú pevnosť; Zrná S adsorbenta musia mať rovnaký stupeň disperzie.

Pri výbere podmienok pre chromatografický proces sa berú do úvahy vlastnosti adsorbenta a adsorbovaných látok.

V klasickej verzii kvapalinovej stĺpcovej chromatografie (LCC) prechádza eluent (PF) cez chromatografickú kolónu, čo je sklenená trubica s priemerom 0,5–5 cm a dĺžkou 20–100 cm, naplnená sorbentom (NP). Eluent sa pohybuje pod vplyvom gravitácie. Rýchlosť jeho pohybu je možné nastaviť pomocou žeriavu v spodnej časti stĺpa. Zmes, ktorá sa má analyzovať, sa umiestni na hornú časť kolóny. Keď sa vzorka pohybuje kolónou, zložky sa oddeľujú. V určitých intervaloch sa odoberajú frakcie eluentu uvoľnené z kolóny, ktoré sa analyzujú akoukoľvek metódou, ktorá umožňuje meranie koncentrácií analytov.

Kolónová adsorpčná chromatografia sa v súčasnosti využíva najmä nie ako samostatná metóda rozboru, ale ako metóda predbežnej (niekedy konečnej) separácie zložitých zmesí na jednoduchšie, t. pripraviť na analýzu inými metódami (vrátane chromatografických). Napríklad zmes tokoferolov sa oddelí na kolóne s oxidom hlinitým, nechá sa prejsť eluentom a frakcia a-tokoferolu sa odoberie na následné fotometrické stanovenie.

Modernizácia zariadení používaných v klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografii z nej urobila jednu zo sľubných a moderných metód analýzy. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia je vhodná metóda na separáciu, preparatívnu izoláciu a kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu neprchavých, termolabilných zlúčenín s nízkou aj vysokou molekulovou hmotnosťou.

V závislosti od typu použitého sorbentu táto metóda využíva 2 možnosti chromatografie: na polárnom sorbente s použitím nepolárneho eluentu (možnosť priamej fázy) a na nepolárnom sorbente s použitím polárneho eluentu - tzv. -výkonná kvapalinová chromatografia (RP HPLC).

Prístrojové vybavenie pre HPLC

Súpravu moderného zariadenia pre HPLC spravidla tvoria dve čerpadlá 3, 4 (obr. 7.1.1.1), riadené mikroprocesorom 5 a dodávajúce eluent podľa špecifického programu. Čerpadlá vytvárajú tlak do 40 MPa. Vzorka sa vstrekuje cez špeciálne zariadenie (injektor) 7 priamo do prúdu eluentu. Po prechode cez chromatografickú kolónu 8 sú látky detegované vysoko citlivým prietokovým detektorom 9, ktorého signál je zaznamenávaný a spracovávaný mikropočítačom 11. V prípade potreby sú frakcie automaticky vyberané v čase špičkového výkonu.

Kolóny pre HPLC sú vyrobené z nehrdzavejúcej ocele s vnútorným priemerom 2 - 6 mm a dĺžkou 10 - 25 cm. Kolóny sú plnené sorbentom (NF). Ako NF sa používa silikagél, oxid hlinitý alebo modifikované sorbenty. Silikagél sa zvyčajne upravuje chemickým zavedením rôznych funkčných skupín do jeho povrchu.

Priebežne detekovaný signál zaznamenáva rekordér. Chromatogram je sekvencia signálov detektora zaznamenaných na magnetofón, ktoré vznikajú, keď jednotlivé zložky zmesi opúšťajú kolónu. V prípade separácie zmesi sú na vonkajšom chromatograme viditeľné samostatné píky. Poloha píku na chromatograme sa používa na účely identifikácie látky, výška alebo plocha píku sa používa na účely kvantitatívneho stanovenia.

Kvalitatívna analýza

Najdôležitejšie charakteristiky chromatogramu - retenčný čas tR a s ním spojený retenčný objem - odrážajú povahu látok, ich schopnosť sorpcie na materiáli stacionárnej fázy, a preto sú za konštantných chromatografických podmienok prostriedky na identifikáciu látky. Pre danú kolónu s určitým prietokom a teplotou je retenčný čas každej zlúčeniny konštantný (obr. 7.1.1.2), kde tR(A) je retenčný čas zložky A analyzovanej zmesi od okamihu jej vstreknutia. do kolóny, kým sa na výstupe z kolóny neobjaví maximálny pík, 1K(ss) - retenčný čas vnútorného štandardu (látka pôvodne neprítomná v analyzovanej zmesi), h - výška píku (mm), ab - šírka píku v polovici jeho výšky , mm.

Na identifikáciu látky pomocou chromatogramu sa zvyčajne používajú štandardné vzorky alebo čisté látky. Porovnajte retenčný čas neznámej zložky IR* s retenčným časom IRCT známych látok. Ale spoľahlivejšia identifikácia meraním relatívneho retenčného času

V tomto prípade sa do kolóny najskôr zavedie známa látka (vnútorný štandard) a zmeria sa jej retenčný čas tR(Bc), potom sa testovaná zmes chromatograficky separuje (chromatografuje), do ktorej sa predbežne pridá vnútorný štandard. Relatívny retenčný čas sa určí podľa vzorca (7.1.1.1).

Kvantitatívna analýza

Táto analýza je založená na závislosti výšky píku h alebo jeho plochy S od množstva látky. Pre úzke vrcholy je vhodnejšie meranie h, pre široké rozmazané vrcholy - S. Plocha vrcholu sa meria rôznymi spôsobmi: vynásobením výšky vrcholu (h) jeho šírkou (ai / 2), meranej v polovici jeho výšky (obr. 7.2.3); plánovanie; pomocou integrátora. Moderné chromatografy sú vybavené elektrickými alebo elektronickými integrátormi.

Na stanovenie obsahu látok vo vzorke sa používajú najmä tri metódy: metóda absolútnej kalibrácie, metóda vnútornej normalizácie a metóda vnútorného štandardu.

Metóda absolútnej kalibrácie je založená na predbežnom stanovení vzťahu medzi množstvom zavedenej látky a plochou alebo výškou píku na chromatograme. Známe množstvo kalibračnej zmesi sa zavedie do chromatogramu a určia sa plochy alebo výšky získaných píkov. Zostavte graf plochy alebo výšky píku z množstva vstreknutej látky. Testovaná vzorka sa analyzuje, zmeria sa plocha alebo výška píku zložky, ktorá sa má stanoviť, a jej množstvo sa vypočíta na základe kalibračnej krivky.

Táto metóda poskytuje informácie iba o relatívnom obsahu zložky v zmesi, ale neumožňuje určiť jej absolútnu hodnotu.

Metóda vnútorného štandardu je založená na porovnaní vybraného parametra vrcholu analytu s rovnakým parametrom štandardnej látky zavedenej do vzorky v známom množstve. Do testovanej vzorky sa zavedie známe množstvo takejto štandardnej látky, ktorej pík je dostatočne dobre oddelený od píkov zložiek testovanej zmesi.

Posledné dve metódy vyžadujú zavedenie korekčných faktorov charakterizujúcich citlivosť použitých detektorov na analyzované látky. Pre rôzne typy detektorov a rôzne látky sa koeficient citlivosti určuje experimentálne.

Kvapalinová adsorpčná chromatografia využíva aj analýzu frakcií roztokov zozbieraných v momente, keď látka opúšťa kolónu. Analýza sa môže uskutočniť rôznymi fyzikálno-chemickými metódami.

Kvapalinová adsorpčná chromatografia sa používa predovšetkým na separáciu organických látok. Táto metóda je veľmi úspešná pri štúdiu zloženia ropy, uhľovodíkov, efektívne oddeľuje trans- a cis-izoméry, alkaloidy atď. HPLC možno použiť na stanovenie farbív, organických kyselín, aminokyselín, cukrov, nečistôt pesticídov a herbicídov, liečivých látok a iné kontaminanty v potravinových výrobkoch.

(hlavne intermolekulárne) na rozhraní. Ako metóda analýzy je HPLC súčasťou skupiny metód, ktorá vzhľadom na zložitosť skúmaných objektov zahŕňa predbežnú separáciu počiatočnej komplexnej zmesi na relatívne jednoduché. Získané jednoduché zmesi sa potom analyzujú konvenčnými fyzikálno-chemickými metódami alebo špeciálnymi metódami vyvinutými pre chromatografiu.

Metóda HPLC je široko používaná v oblastiach ako chémia, petrochémia, biológia, biotechnológia, medicína, spracovanie potravín, ochrana životného prostredia, výroba liekov a mnoho ďalších.

Podľa mechanizmu separácie analyzovaných alebo separovaných látok sa HPLC delí na adsorpčnú, distribučnú, iónomeničovú, vylučovaciu, ligandovú a iné.

Treba mať na pamäti, že v praktickej práci často prebieha separácia nie jedným, ale viacerými mechanizmami súčasne. Takže separácia vylúčenia môže byť komplikovaná adsorpčnými efektmi, adsorpciou - distribúciou a naopak. Zároveň platí, že čím väčší je rozdiel v látkach vo vzorke z hľadiska stupňa ionizácie, zásaditosti alebo kyslosti, z hľadiska molekulovej hmotnosti, polarizovateľnosti a iných parametrov, tým je pravdepodobnejšie, že sa objaví iný separačný mechanizmus. pre takéto látky.

Normálna fáza HPLC

Stacionárna fáza je polárnejšia ako mobilná fáza, takže v zložení eluentu prevláda nepolárne rozpúšťadlo:

Hexán:izopropanol = 95:5 (pre nízkopolárne látky)
Chloroform:metanol = 95:5 (pre stredne polárne látky)
Chloroform:metanol = 80:20 (pre vysoko polárne látky)

HPLC na reverznej fáze

Stacionárna fáza je menej polárna ako mobilná fáza, takže voda je v eluente takmer vždy prítomná. V tomto prípade je vždy možné zabezpečiť úplné rozpustenie BAS v mobilnej fáze, takmer vždy je možné použiť UV detekciu, takmer všetky mobilné fázy sú vzájomne miešateľné, je možné použiť gradientovú elúciu, kolónu je možné rýchlo prerobiť - ekvilibrovaný, kolónu možno regenerovať.

Bežné eluenty pre HPLC s reverznou fázou sú:

Acetonitril: voda
metanol:voda
Izopropanol: voda

Matrice pre HPLC

Matrice používané v HPLC sú anorganické zlúčeniny, ako je oxid kremičitý (silikagél) alebo oxid hlinitý, alebo organické polyméry, ako je polystyrén (zosieťovaný divinylbenzénom) alebo polymetakrylát. Silikagél je, samozrejme, teraz všeobecne akceptovaný.

Hlavné vlastnosti matrice:

veľkosť častíc (um);
Vnútorná veľkosť pórov (Å, nm).

Získanie silikagélu pre HPLC:

Tvorba mikrosfér kyseliny polykremičitej;
Sušenie častíc silikagélu;
Oddelenie vzduchu.

Sorpčné častice:

Pravidelné (sférické): vyššia odolnosť voči tlaku, vyššia cena;
Nesférický: nižšia odolnosť voči tlaku.

Veľkosť pórov pri HPLC je jedným z najdôležitejších parametrov. Čím menšia je veľkosť pórov, tým horšia je ich priepustnosť pre molekuly eluovaných látok. A následne tým horšia je sorpčná schopnosť sorbentov. Čím väčšie sú póry, tým nižšia je po prvé mechanická stabilita častíc sorbentu a po druhé, čím menší je sorpčný povrch, tým horšia je účinnosť.

Štepy v stacionárnej fáze

Normálna fáza HPLC:

Stacionárna fáza očkovaná propylnitrilom (nitril);
Stacionárna fáza s propylamínovým štepením (amín).

HPLC na reverznej fáze:

Stacionárna fáza s alkylovým štepom;
Stacionárna fáza s alkylsilylovým štepom.

End-capping - ochrana nenavrúbľovaných oblastí sorbentu dodatočným štepením "malými" molekulami. Hydrofóbna koncovka (C1, C2): vyššia selektivita, horšia zmáčavosť; hydrofilný end-capping (diol): nižšia selektivita, vyššia zmáčavosť.

HPLC detektory

UV
diódové pole
Fluorescenčné
Elektrochemické
Refraktometrické
hromadne selektívne

Odkazy

Nadácia Wikimedia. 2010.

Pozrite si, čo je „Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia“ v iných slovníkoch:

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia-- [A.S. Goldberg. Anglický ruský energetický slovník. 2006] Témy energie vo všeobecnosti EN vysokoúčinná kvapalinová chromatografiaHPLC … Technická príručka prekladateľa

Pojem vysokoúčinná kvapalinová chromatografia Anglický výraz vysokoúčinná kvapalinová chromatografia Synonymá Skratky HPLC, HPLC Súvisiace pojmy adsorpcia, oligopeptid, proteomika, sorbent, fullerén, endohedrická, chromatografia… …

Kvapalinová chromatografia, aby sa zvýšila účinnosť separácie, rozpúšťadlo (eluent) pod tlakom (viac ako 3x107 Pa) sa čerpá cez kolóny naplnené sorbentom s časticami malého priemeru (do 1 μm) a perfúzna ... ...

Typ chromatografie, v ktorom kvapalina (eluent) slúži ako mobilná fáza a je to stacionárna fáza. sorbent, tv. nosič s kvapalinou alebo gélom aplikovaným na jeho povrch. Uskutočňuje sa v kolóne naplnenej sorbentom (stĺpcová chromatografia), na plochom ... ... Prírodná veda. encyklopedický slovník

- [κρώμα (υroma) color] proces založený na nerovnakej schopnosti jednotlivých zložiek zmesi (kvapalnej alebo plynnej) zotrvať na povrchu adsorbentu tak pri absorpcii z nosného prúdu, ako aj pri ... ... Geologická encyklopédia

- (z inej gréčtiny ... Wikipedia

Termín chromatografia Anglický termín chromatografia Synonymá Skratky Združené termíny vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, klatrát, laboratórium na čipe, porozimetria, proteóm, proteomika, sorbent, enzým, fullerén, endohedrický… … Encyklopedický slovník nanotechnológie

Kvapalinová chromatografia založená na rozklade. schopnosť separovaných iónov iónovej výmeny s fix. sorbentové ióny vznikajúce ako výsledok disociácie ionogénnych skupín posledne menovaných. Katiónové výmenníky sa používajú na oddelenie katiónov, pre ... ... Chemická encyklopédia

HPLC- vysokoúčinná kvapalinová chromatografia ... Slovník skratiek ruského jazyka

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je jednou z účinných metód separácie zložitých zmesí látok, ktorá má široké využitie ako v analytickej chémii, tak aj v chemickej technológii. Základom chromatografickej separácie je participácia ... Wikipedia

knihy

Praktická vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, Veronica R. Mayer. Čitateľovi predstavujeme 5. vydanie knihy, ktorá je rozšírená o moderné metódy a zariadenia. V knihe sa veľa zlepšilo a pridalo sa veľké množstvo odkazov. Miesta v texte, kde...

9885 0

HPLC je kvapalinová stĺpcová chromatografia, pri ktorej možno použiť rôzne sorpčné mechanizmy. HPLC je v podstate moderná forma klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografie. Nižšie sú uvedené niektoré z najvýznamnejších kvalitatívnych charakteristík HPFA:
- vysoká rýchlosť procesu, ktorá umožnila skrátiť dobu separácie z niekoľkých hodín a dní na minúty;
- minimálny stupeň rozmazania chromatografických zón, ktorý umožňuje oddeliť zlúčeniny, ktoré sa len málo líšia v sorpčných konštantách;
- vysoký stupeň mechanizácie a automatizácie separácie a spracovania informácií, vďaka čomu kolónová kvapalinová chromatografia dosiahla novú úroveň reprodukovateľnosti a presnosti.

Intenzívne štúdie posledných desaťročí, obrovské množstvo nahromadených experimentálnych údajov dnes umožňuje hovoriť o klasifikácii variantov v rámci metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Samozrejme, v tomto prípade zostáva v platnosti klasifikácia podľa vyššie uvedeného sorpčného mechanizmu.

Spoločná klasifikácia je založená na porovnávacej polarite mobilnej a stacionárnej fázy. Rozlišuje sa medzi normálnou a reverznou fázovou chromatografiou.

Chromatografia na normálnej fáze (NPC) je variant HPLC, kde je mobilná fáza menej polárna ako stacionárna a existuje dôvod domnievať sa, že hlavným faktorom určujúcim retenciu je interakcia sorbátov priamo s povrchom alebo objemom sorbentu. .

Chromatografia na reverznej fáze (RPC) je variantom HPLC, kde je mobilná fáza polárnejšia ako stacionárna a retencia sa určuje priamym kontaktom molekúl sorbátu s povrchom alebo objemom sorbentu; v tomto prípade sa ionizované sorbáty nevymieňajú za ióny mobilnej fázy adsorbované na povrchu.

Iónovo-výmenná chromatografia - variant, pri ktorom sa sorpcia uskutočňuje výmenou sorbovaných iónov mobilnej fázy za ióny chromatografovaných látok; ligand-výmenná chromatografia môže byť stanovená presne rovnakým spôsobom.

Chromatografia na dynamicky modifikovaných sorbentoch je variantom HPLC, pri ktorej sorbát neinteraguje priamo s povrchom sorbentu, ale vstupuje do asociácie s molekulami povrchových vrstiev eluentu.
Iónová párová chromatografia je variant reverznej fázovej chromatografie ionizovaných zlúčenín, pri ktorej sa do mobilnej fázy pridáva hydrofóbny protiión, ktorý kvalitatívne mení sorpčné charakteristiky systému.

Veľkostne vylučovacia chromatografia je metóda na separáciu zlúčenín podľa ich molekulových hmotností, založená na rozdiele v rýchlosti difúzie v póroch stacionárnej fázy molekúl rôznych veľkostí.

Pre HPFA je veľmi dôležitou charakteristikou veľkosť sorbentov, zvyčajne 3-5 µm, teraz až 1,8 µm. To umožňuje rýchlo a úplne oddeliť zložité zmesi látok (priemerná doba analýzy je od 3 do 30 minút).

Problém separácie sa rieši pomocou chromatografickej kolóny, čo je trubica naplnená sorbentom. Počas analýzy sa kvapalina (eluent) určitého zloženia privádza cez chromatografickú kolónu konštantnou rýchlosťou. Do tohto prúdu sa vstrekuje presne odmeraná dávka vzorky. Zložky vzorky zavedené do chromatografickej kolóny sa v dôsledku svojej rozdielnej afinity k sorbentu kolóny pohybujú pozdĺž nej rôznou rýchlosťou a dostávajú sa k detektoru postupne v rôznych časoch.

Chromatografická kolóna je teda zodpovedná za selektivitu a separačnú účinnosť zložiek. Výberom rôznych typov stĺpcov môžete ovládať stupeň separácie analyzovaných látok. Zlúčeniny sú identifikované podľa ich retenčného času. Kvantitatívne stanovenie každej zo zložiek sa vypočíta na základe veľkosti analytického signálu nameraného pomocou detektora pripojeného k výstupu chromatografickej kolóny.

Sorbenty. Rozvoj HPLC je vo veľkej miere spojený s vytvorením nových generácií sorbentov s dobrými kinetickými vlastnosťami a rôznymi termodynamickými vlastnosťami. Hlavným materiálom pre sorbenty v HPLC je silikagél. Je mechanicky pevný a má výraznú pórovitosť, čo dáva veľkú výmennú kapacitu pre malé veľkosti kolón. Najbežnejšia veľkosť častíc je 5-10 mikrónov. Čím bližšie ku guľovitému tvaru častíc, tým nižší je prietokový odpor, tým vyššia je účinnosť, najmä ak sa preosieva veľmi úzka frakcia (napríklad 7 + 1 mikrónov).

Špecifický povrch silikagélu je 10-600 m/g. Silikagél môže byť modifikovaný rôznymi chemickými skupinami naočkovanými na povrch (C-18, CN, NH2, SO3H), čo umožňuje použitie sorbentov na jeho báze na separáciu rôznych tried zlúčenín. Hlavnou nevýhodou silikagélu je jeho nízka chemická odolnosť pri pH< 2 и рН >9 (oxid kremičitý sa rozpúšťa v zásadách a kyselinách). Preto v súčasnosti prebieha intenzívne hľadanie sorbentov na báze polymérov, ktoré sú stabilné pri pH od 1 do 14, napríklad na báze polymetylmetakrylátu, polystyrénu atď.

Sorbenty pre iónovo-výmennú chromatografiu. Vzhľadom na zvláštnosti separácie (v kyslom alebo alkalickom prostredí) je hlavným materiálom sorbent-polystyrén s divinylbenzénom rôzneho stupňa zosieťovania so skupinami SO3 -H + navrúbľovanými na ich povrch (silne kyslé katexy) alebo -COO -Naf (slabo kyslé katexové), -H2N + (CH3) 3Cl- (silne zásadité aniónomeniče) alebo -N+HR2Cl- (slabé zásadité aniónomeniče).

Sorbenty pre gélovú penetračnú chromatografiu. Hlavným typom je styrén-DVB. Používajú sa aj makroporézne sklá, metylmetakrylát, silikagél. Pre iónovo-vylučovaciu chromatografiu sa používajú rovnaké sorbenty.
Čerpadlá. Na zabezpečenie prietoku mobilnej fázy (MP) kolónou so špecifikovanými parametrami sa používajú vysokotlakové čerpadlá. Najdôležitejšie špecifikácie čerpadiel LC sú: rozsah prietoku; maximálny pracovný tlak; reprodukovateľnosť toku; rozsah pulzácie dodávky rozpúšťadla.

Podľa povahy prívodu rozpúšťadla môžu mať čerpadlá konštantný prívod (prietok) a konštantný tlak. V zásade sa pri analytickej práci používa režim konštantného prietoku, pri plnení kolón sa používa režim konštantného tlaku. Podľa princípu činnosti sú čerpadlá rozdelené na injekčné čerpadlá a piestové čerpadlá s vratným pohybom.

injekčné čerpadlá. Čerpadlá tohto typu sa vyznačujú takmer úplnou absenciou pulzácií v toku mobilnej fázy počas prevádzky. Nevýhody čerpadla: a) vysoká spotreba času a rozpúšťadla na preplachovanie pri výmene rozpúšťadla; b) pozastavenie separácie počas plnenia čerpadla; c) veľké rozmery a hmotnosť pri zabezpečení vysokého prietoku a tlaku (potrebujete silný motor a veľkú silu piestu pri jeho veľkej ploche).

Piestové piestové čerpadlá. Čerpadlá tohto typu zabezpečujú konštantný objemový prietok mobilnej fázy po dlhú dobu. Maximálny pracovný tlak 300-500 atm, prietok 0,01-10 ml/min. Reprodukovateľnosť objemového krmiva - 0,5%. Hlavnou nevýhodou je, že rozpúšťadlo sa privádza do systému vo forme série po sebe nasledujúcich impulzov, takže dochádza k pulzáciám tlaku a prietoku.

To je hlavný dôvod zvýšeného šumu a znecitlivenia takmer všetkých detektorov používaných v LC, najmä elektrochemických. Spôsoby boja proti pulzáciám: pomocou dvojitých čerpadiel alebo dvojpiestového čerpadla Bag-lai, pomocou tlmiacich zariadení a elektronických zariadení.

Množstvo objemového posuvu je určené tromi parametrami: priemer piestu (zvyčajne 3,13; 5,0; 7,0 mm), jeho amplitúda (12-18 mm) a frekvencia (ktorá závisí od rýchlosti otáčania motora a prevodovky).

Dávkovače. Účelom dávkovača je preniesť vzorku pri atmosférickom tlaku na vstup do kolóny pri tlakoch až niekoľko atmosfér. Je dôležité, aby sa v dávkovači nenachádzali „mŕtve“ objemy, ktoré mobilná fáza nedokáže vymyť a aby sa vzorka nevymyla počas dávkovania. Najprv boli dávkovače v LC podobné dávkovačom plynu s membránovým prepichnutím. Membrány však nedržia viac ako 50-100 atm, ich chemická odolnosť je nedostatočná, ich kusy znečisťujú kolónové filtre a kapiláry.

V kvapalnej fáze je rýchlosť difúzie oveľa nižšia ako v plynnej fáze. Preto je možné upustiť od prietokovej zarážky - vzorka sa v dávkovači nestihne rozmazať. Počas vstrekovania vzorky do dávkovača špeciálny kohútik uzavrie prietok rozpúšťadla. Tlak na vstupe do kolóny rýchlo klesá, po niekoľkých sekundách je možné vzorku vstreknúť do dávkovacej komory bežnou mikrostriekačkou. Potom sa dávkovač uzamkne, zapne sa prietok rozpúšťadla a dôjde k separácii.

Tlak, ktorý tento ventil drží, je až 500-800 atm. Ale keď sa tok zastaví, rovnováha v kolóne je narušená, čo môže viesť k objaveniu sa „prázdnych“ ďalších píkov.

Slučkové dávkovače sú najpoužívanejšie. Pri plnení dávkovača pod vysokým tlakom sú prívody 1,2 a kanál medzi nimi. Vstupy 3-6, kanály medzi nimi a dávkovacia slučka sú pod atmosférickým tlakom, čo vám umožňuje naplniť slučku injekčnou striekačkou alebo pumpou. Ako sa dávkovač otáča, prúd mobilnej fázy tlačí vzorku do kolóny. Na zníženie chyby sa slučka premyje 5-10-násobkom objemu vzorky. Ak je vzorka malá, môže sa vstreknúť do slučky pomocou mikrostriekačky. Objem slučky je zvyčajne 5-50 μl.

NA. Voinov, T.G. Volova

Kvapalinová chromatografia Ide o metódu separácie a analýzy komplexných zmesí látok, v ktorých je mobilnou fázou kvapalina. Je použiteľná na separáciu širšieho spektra látok ako metóda plynovej chromatografie. Je to spôsobené tým, že väčšina látok nie je prchavá, mnohé z nich sú pri vysokých teplotách nestabilné (najmä vysokomolekulárne zlúčeniny) a pri premene do plynného skupenstva sa rozkladajú. Separácia látok kvapalinovou chromatografiou sa najčastejšie uskutočňuje pri izbovej teplote.

Vlastnosti všetkých typov kvapalinovej chromatografie sú spôsobené tým, že mobilná fáza v nej je kvapalina a sorpcia zložiek z plynného a kvapalného eluentu prebieha odlišne. Ak pri plynovej chromatografii plní nosný plyn iba transportnú funkciu a nie je sorbovaný stacionárnou fázou, potom je kvapalná mobilná fáza v kvapalinovej chromatografii aktívnym eluentom, jej molekuly môžu byť sorbované stacionárnou fázou. Pri prechode kolónou musia molekuly zložiek analyzovanej zmesi, ktoré sa nachádzajú v eluente, vytesniť molekuly eluentu z povrchovej vrstvy sorbentu, čo vedie k zníženiu energie interakcie medzi molekulami sorbentu. analyzovanej látky a povrchu sorbentu. Preto hodnoty zadržaných objemov V R, úmerná zmene voľnej energie systému, je pri kvapalinovej chromatografii menšia ako pri plynovej chromatografii a rozsah linearity sorpčnej izotermy pri kvapalinovej chromatografii je širší.

Použitím rôznych eluentov je možné zmeniť retenčné parametre a selektivitu chromatografického systému. Selektivita v kvapalinovej chromatografii, na rozdiel od plynovej, nie je určená jedným, ale dvoma faktormi - povahou mobilnej (eluentnej) a stacionárnej fázy.

Kvapalná mobilná fáza má vyššiu hustotu a viskozitu ako plynná fáza, difúzne koeficienty D dobre o 3–4 rády nižšie ako v plyne. To vedie k spomaleniu prenosu hmoty v kvapalinovej chromatografii v porovnaní s plynovou chromatografiou. Van Deemterova rovnica vzhľadom na skutočnosť, že člen V nezohráva úlohu v kvapalinovej chromatografii ( D dobre  D G), mení sa aj grafická závislosť účinnosti H na lineárnej rýchlosti toku mobilnej fázy má tvar znázornený na obr. 1.9.

V klasickej verzii kolónovej kvapalinovej chromatografie sa do sklenenej kolóny vysokej 1–2 m, naplnenej sorbentom s veľkosťou častíc 100 μm a eluentom, vstrekne analyzovaná vzorka rozpustená v eluente a eluent sa nechá prejsť cez odoberaním častí eluátu na výstupe z kolóny. Táto verzia kvapalinovej chromatografie sa stále používa v laboratórnej praxi, ale keďže prietok eluentu pri pôsobení gravitácie je nízky, analýza je zdĺhavá.

Moderná verzia kvapalinovej chromatografie, takzvaná vysokoúčinná kvapalinová chromatografia HPLC, využíva volumetrické a povrchovo pórovité sorbenty s veľkosťou častíc 5–10 μm, tlakové čerpadlá, ktoré zabezpečujú tlak v systéme až 400 atm a vysoko citlivé detektory. Rýchly prenos hmoty a vysoká separačná účinnosť umožňujú použitie HPLC na separáciu molekúl (kvapalinová adsorpčná a kvapalinová kvapalinová deliaca chromatografia), na separáciu iónov (iónovo-výmenná, iónová, iónovo-párová chromatografia), na separácia makromolekúl (size-exclusion chromatografia).

1.3. ZADRŽANIE A PEVNOSŤ ROZPÚŠŤADLA

Aby sa analyty separovali na kolóne, ako je uvedené vyššie, kapacitný faktor k" musí byť väčší ako 0, tj látky musia byť zadržané stacionárnou fázou, sorbentom. Kapacitný faktor by však nemal byť príliš vysoký. veľké, aby sa získal prijateľný elučný čas. Ak sa pre danú zmes látok zvolí stacionárna fáza, ktorá ich obsahuje, potom ďalšia práca na vývoji analytického postupu spočíva vo výbere rozpúšťadla, ktoré by v ideálnom prípade poskytlo rôzne pre všetky komponenty, ale prijateľné nie veľmi veľké k. To sa dosiahne zmenou elučnej sily rozpúšťadla.

V prípade adsorpčnej chromatografie na silikagéli alebo oxide hlinitom sa pevnosť dvojzložkového rozpúšťadla (napríklad hexánu s prídavkom izopropanolu) spravidla zvyšuje zvýšením obsahu polárnej zložky (izopropanolu) v ňom. alebo znížené znížením obsahu izopropanolu. Ak sa obsah polárnej zložky príliš zníži (menej ako 0,1 %), mala by sa nahradiť slabšou elučnou silou. Urobí sa to isté, pričom sa buď polárna alebo nepolárna zložka nahradí inými, aj keď tento systém neposkytuje požadovanú selektivitu vzhľadom na zložky zmesi, ktoré sú predmetom záujmu. Pri výbere systémov rozpúšťadiel sa berú do úvahy tak rozpustnosti zložiek zmesi, ako aj eluotropné série rozpúšťadiel zostavené rôznymi autormi.

Približne rovnakým spôsobom sa volí sila rozpúšťadla v prípade použitia očkovaných polárnych fáz (nitril, amino, diol, nitro atď.), pričom sa berú do úvahy možné chemické reakcie a vylúčenie rozpúšťadiel nebezpečných pre fázu (napr. aldehydy a ketóny pre amino fázu).

V prípade chromatografie na reverznej fáze sa sila rozpúšťadla zvyšuje zvýšením obsahu organickej zložky (metanol, acetonitril alebo THF) v eluente a znižuje sa pridaním väčšieho množstva vody. Ak nie je možné dosiahnuť požadovanú selektivitu, použije sa iná organická zložka alebo sa pokúsia o jej zmenu pomocou rôznych prísad (kyseliny, iónové párové činidlá atď.).

Pri separáciách iónovo-výmennou chromatografiou sa sila rozpúšťadla mení zvyšovaním alebo znižovaním koncentrácie tlmivého roztoku alebo zmenou pH, v niektorých prípadoch sa používa modifikácia organickými látkami.

Najmä v prípade komplexných prírodných a biologických zmesí však často nie je možné zvoliť silu rozpúšťadla tak, aby sa všetky zložky vzorky eluovali v prijateľnom čase. Potom sa treba uchýliť k gradientovej elúcii, t.j. použite rozpúšťadlo, ktorého elučná sila sa počas analýzy mení tak, že sa neustále zvyšuje podľa vopred určeného programu. Touto technikou je možné dosiahnuť elúciu všetkých zložiek komplexných zmesí v relatívne krátkom čase a ich separáciu na zložky vo forme úzkych píkov.

1.6.1. Adsorpčná kvapalinová chromatografia. Adsorpčná kvapalinová chromatografia sa v závislosti od polarity stacionárnej a mobilnej fázy delí na chromatografiu s normálnou fázou (NPC) a chromatografiu s reverznou fázou (RPC). V NPC sa používa polárny adsorbent a nepolárne mobilné fázy, v OFC sa používa nepolárny adsorbent a polárne mobilné fázy, ale v oboch prípadoch je výber mobilnej fázy často dôležitejší ako výber mobilnej fázy. stacionárny. Stacionárna fáza musí obsahovať látky, ktoré sa majú oddeliť. Mobilná fáza, teda rozpúšťadlo, musí poskytovať rôzne kapacity kolóny a účinné separácie v primeranom čase.

Ako stacionárna fáza v adsorpčnej kvapalinovej chromatografii sa používajú polárne a nepolárne jemne dispergované porézne materiály so špecifickým povrchom väčším ako 50 m 2 /g. Polárne adsorbenty (SiO 2, Al 2 O 3, florisil a pod.) majú na povrchu slabo kyslé skupiny, schopné zadržiavať látky so zásaditými vlastnosťami. Tieto adsorbenty sa používajú hlavne na separáciu nepolárnych a stredne polárnych zlúčenín. Ich nevýhodou je vysoká citlivosť na obsah vody v použitých eluentoch. Na odstránenie tohto nedostatku sa polárne sorbenty upravujú s amínmi, diolmi a inými činidlami, čo vedie k povrchovému očkovaniu týchto činidiel, modifikácii povrchu a zmene selektivity vzhľadom na analyty.

Nepolárne adsorbenty (grafitizované sadze, diatomit, kremelina) sú neselektívne voči polárnym molekulám. Na získanie nepolárnych adsorbentov sa nepolárne skupiny často navrúbľujú na povrch, napríklad silikagélu, napríklad alkylsilyl - SiR3, kde R - alkylové skupiny sú C2 - C22.

Mobilná fáza by mala úplne rozpustiť analyzovanú vzorku, mala by mať nízku viskozitu (aby boli difúzne koeficienty dostatočne veľké), je žiaduce, aby z nej bolo možné oddeliť oddelené zložky. Musí byť inertný k materiálom všetkých častí chromatografu, bezpečný, lacný, vhodný pre detektor.

Mobilné fázy používané v kvapalinovej chromatografii sa líšia svojou elučnou silou. Elučná sila rozpúšťadla ukazuje, koľkokrát je sorpčná energia daného eluentu na danom adsorbente väčšia ako sorpčná energia eluentu zvoleného ako štandard, napríklad n-heptánu. Slabé rozpúšťadlá sú slabo adsorbované stacionárnou fázou, preto sú distribučné koeficienty sorbovaných látok (sorbátov) vysoké. Naopak, silné rozpúšťadlá sa dobre adsorbujú, takže rozdeľovacie koeficienty sorbátu sú nízke. Čím silnejšie je rozpúšťadlo, tým vyššia je rozpustnosť analyzovanej vzorky v ňom, tým silnejšia je interakcia rozpúšťadlo-sorbát.

Pre zabezpečenie vysokej účinnosti separácie na kolóne je potrebné zvoliť mobilnú fázu, ktorá má optimálnu polaritu pre zmes, ktorá sa má separovať za zvolených separačných podmienok. Typicky sa najprv vyberie stacionárna fáza, ktorá má polaritu blízku polarite zložiek, ktoré sa majú oddeliť. Potom sa vyberie mobilná fáza, čím sa zabezpečí, že koeficient kapacity k" sa ukázalo byť v rozsahu od 2 do 5. Ak je polarita mobilnej fázy príliš blízka polarite stacionárnej fázy, čas zdržania komponentov bude príliš krátky a ak polarity mobilnej a stacionárnej fázy fázy sa veľmi líšia, retenčný čas je príliš dlhý.

Pri výbere mobilných fáz sa riadia takzvaným eluotropným radom, založeným na použití indexov polarity. Snider R", ktorý rozdeľuje všetky rozpúšťadlá na silné (polárne) a slabé (slabo polárne a nepolárne). Stupnica polarity je založená na rozpustnosti látok používaných ako mobilné fázy v dioxáne, nitrometáne a etanole.

Tabuľka 1.2 ukazuje hodnoty indexu polarity a elučnej sily (vzhľadom na Si02) množstva rozpúšťadiel najčastejšie používaných v kvapalinovej chromatografii ako mobilné fázy. Sú tu tiež uvedené limity priehľadnosti pre krátke vlnové dĺžky týchto rozpúšťadiel, čo uľahčuje výber podmienok na detekciu zložiek zmesi.

Tabuľka 1.2

Charakteristika rozpúšťadiel používaných v kvapalinovej chromatografii

Solventný	Index polarity	Elučný výkon (SiO 2)	Limit transparentnosti pre krátke vlny
Fluoralkán
cyklohexán
n-Hexán
Tetrachlórmetán
Diizopropyléter

dietyléter
dichlórmetán
tetrahydrofurán
chloroform

Octová kyselina


acetonitril
nitrometán

Kvapalinová chromatografia často nepoužíva jednotlivé rozpúšťadlá, ale ich zmesi. Často malé pridanie iného rozpúšťadla, najmä vody, výrazne zvyšuje elučnú silu eluentu.

Pri separácii viaczložkových zmesí nemusí jedna mobilná fáza ako eluent oddeliť všetky zložky vzorky v primeranom čase. V tomto prípade sa používa postupná alebo gradientová elúcia, pri ktorej sa počas chromatografie postupne používajú stále silnejšie eluenty, čo umožňuje elúciu vysoko zadržaných látok za kratší čas.

V kvapalinovej chromatografii sú niektoré empirický pravidlá, ktoré sú veľmi užitočné pri výbere eluentu:

 sorpcia zlúčeniny sa spravidla zvyšuje so zvyšujúcim sa počtom dvojitých väzieb a OH skupín v nej;

 pokles sorpcie v rade organických zlúčenín: kyselinyalkoholyaldehydyketónyesterynenasýtené uhľovodíkynasýtené uhľovodíky;

 na separáciu látok rôznej polarity a separácie látok rôznych tried sa používa chromatografia na normálnej fáze: analyzovaná vzorka sa rozpustí a eluuje nepolárnym eluentom, zlúčeniny rôznych tried opúšťajú kolónu s polárnym adsorbentom rôzne časy, pričom retenčný čas zlúčenín s rôznymi funkčnými skupinami sa pri prechode z nepolárnych zlúčenín na slabo polárne zvyšuje. Pre veľmi polárne molekuly sú retenčné časy také dlhé, že analýza nie je možná pri použití nepolárneho eluentu. Na skrátenie retenčného času polárnych zložiek sa prechádza na polárne eluenty;

 pri variante s reverznou fázou stacionárna fáza (nepolárny adsorbent) silnejšie adsorbuje nepolárnu zložku z polárnych eluentov, napríklad z vody;

 Znížením polarity eluentu pridaním menej polárneho rozpúšťadla je možné znížiť retenciu zložiek.

1.6.2. Deliaca kvapalinová chromatografia. Pri deliacej alebo kvapalinovej chromatografii je oddelenie zložiek analyzovanej vzorky spôsobené rozdielmi v koeficientoch ich distribúcie medzi dvoma kvapalnými fázami, ktoré sa navzájom nemiešajú, z ktorých jedna je stacionárna a nachádza sa na povrchu. alebo v póroch pevného nepohyblivého nosiča a druhý je mobilný.

Z hľadiska povahy interakčných síl, ktoré spôsobujú rozdielnu distribúciu medzi dvoma fázami látok, ktoré sa líšia svojou chemickou štruktúrou, je distribučná chromatografia podobná adsorpčnej chromatografii, teda aj tu je separácia založená na rozdiele síl intermolekulárna interakcia medzi zložkami analyzovanej vzorky so stacionárnou a mobilnou kvapalnou fázou.

V závislosti od techniky výkonu môže byť deliaca chromatografia, podobne ako adsorpčná chromatografia, stĺpcová alebo rovinná (papierová alebo tenká vrstva).

Ako tuhé nosiče sa používajú látky, ktoré sú indiferentné k mobilnému rozpúšťadlu a zložkám analyzovanej vzorky, ale sú schopné udržať stacionárnu fázu na povrchu a v póroch. Najčastejšie sa ako nosiče používajú polárne látky (celulóza, silikagél, škrob). Aplikujú sa na stacionárnu fázu – polárne rozpúšťadlo, najčastejšie voda alebo alkohol. V tomto prípade sa ako mobilné fázy používajú menej polárne alebo nepolárne látky (alkoholy, amíny, ketóny, uhľovodíky atď.). Tento typ deliacej chromatografie sa nazýva normálna fáza. Používa sa na oddelenie polárnych látok.

Druhý variant deliacej chromatografie sa líši tým, že ako stacionárna tuhá fáza sa používajú nepolárne nosiče (kaučuk, PTFE, hydrofobizovaný silikagél), ako stacionárna kvapalná fáza nepolárne rozpúšťadlá (uhľovodíky) a ako stacionárna kvapalná fáza polárne rozpúšťadlá (alkoholy, aldehydy). ) ako mobilná kvapalná fáza, ketóny atď., často voda). Tento variant deliacej chromatografie sa nazýva reverzná fáza a používa sa na separáciu nepolárnych látok.

Na dosiahnutie optimálnej separácie zložiek analyzovanej vzorky je veľmi dôležitý výber mobilnej fázy. Rozpúšťadlá (mobilné a stacionárne kvapalné fázy) by sa mali vyberať tak, aby sa distribučné koeficienty zložiek zmesi výrazne líšili. Kvapalné fázy podliehajú nasledovnému požiadavky:

1) použité rozpúšťadlá by mali dobre rozpúšťať separované látky a ich rozpustnosť v stacionárnej fáze by mala byť väčšia ako v mobilnej;

2) rozpúšťadlá používané ako mobilná a stacionárna fáza musia byť vzájomne nasýtené, t.j. zloženie rozpúšťadla musí byť počas prechodu kolónou konštantné;

3) interakcia rozpúšťadiel používaných ako mobilná fáza so stacionárnou fázou by mala byť minimálna.

Najčastejšie sa pri deliacej kvapalinovej chromatografii ako mobilné kvapalné fázy nepoužívajú jednotlivé látky, ale ich zmesi v rôznych pomeroch. To umožňuje regulovať polaritu mobilnej fázy, meniť pomer polarít mobilnej a stacionárnej fázy a dosiahnuť optimálne podmienky na separáciu zložiek konkrétnej analyzovanej zmesi.

Významnou nevýhodou tejto chromatografickej metódy je pomerne rýchle vymývanie usadenej stacionárnej kvapalnej fázy z nosiča. Na jej odstránenie sa rozpúšťadlo použité ako mobilná fáza nasýti látkou použitou ako stacionárna kvapalná fáza alebo sa stacionárna kvapalná fáza stabilizuje naočkovaním na nosič.

Variáciou deliacej kvapalinovej chromatografie je široko používaná metóda HPLC.

Najbežnejšie chromatografické systémy sú systémy, ktoré majú modulárny princíp zostavy. Čerpadlá, odplyňovače, detektory, dávkovače (autosamplery), kolónové pece, zberače frakcií, ovládacie prvky chromatografického systému a zapisovače sú dostupné ako samostatné moduly. Široká škála modulov umožňuje flexibilne riešiť rôzne analytické problémy, v prípade potreby rýchlo meniť konfiguráciu systému s minimálnymi nákladmi. Zároveň sa vyrábajú aj monomodulárne (integrované) LC, ktorých hlavnou výhodou je miniaturizácia jednotlivých blokov a kompaktnosť zariadenia.

V závislosti od spôsobu elúcie sa kvapalinové chromatografy delia na izokratické a gradientové.

Schéma izokratického chromatografu

Mobilná fáza z nádrže (1) cez vstupný filter (9) je dodávaná vysokotlakovým presným čerpadlom (2) do systému vstupu vzorky (3) - ručného injektoru alebo autosampleru, kde je vzorka tiež vstrekovaná . Ďalej cez in-line filter (8) vstupuje vzorka s prúdom mobilnej fázy do separačného prvku (prvkov) (4) - cez predkolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a je odstránený do odtokovej nádrže (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaregistruje a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od vyhotovenia funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (zvyčajne ovládač čerpadla alebo systému), z klávesníc každého z modulov systému alebo riadiacim programom z osobného počítača.

V prípade gradientovej elúcie sa používajú dva zásadne odlišné typy kvapalinových chromatografov. Líšia sa bodom vzniku gradientu zloženia mobilnej fázy.

Schéma gradientového chromatografu s tvorbou gradientu zloženia mobilnej fázy na nízkotlakovej linke.

Mobilná fáza z nádrží (1) cez vstupné filtre (9) a gradientový programátor (10) je privádzaná vysokotlakovým presným čerpadlom (2) do systému vstrekovania vzoriek (3) - ručný injektor alebo autosampler. , kde sa vzorka tiež vstrekuje. Činnosť ventilov gradientového programátora je riadená buď riadiacim modulom systému (čerpadlo alebo regulátor) alebo riadiacim programom PC. Systémy tohto typu tvoria binárny, trojrozmerný a štvorrozmerný gradient. Forma funkcie spracovania gradientu závisí od konkrétneho riadiaceho modulu alebo riadiaceho programu, ako aj od funkčnosti riadeného a riadiaceho modulu. Ďalej cez in-line filter (8) vstupuje vzorka s prúdom mobilnej fázy do separačného prvku (prvkov) (4) - cez predkolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a odvádza sa do odtokovej nádrže (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaregistruje a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od vyhotovenia funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (spravidla ovládač čerpadla alebo systému), alebo riadiacim programom z osobného počítača. V prípade ovládania riadiaceho modulu je možné samostatne ovládať detektor z vlastnej klávesnice.

Napriek zjavnej príťažlivosti takýchto systémov (používajú iba jedno vysokotlakové presné čerpadlo) majú tieto systémy množstvo nevýhod, z ktorých hlavnou je azda veľká potreba dôkladného odplynenia komponentov mobilnej fázy ešte pred nízkotlakový mixér (komora gradientového programátora). Vykonáva sa pomocou špeciálnych prietokových odplyňovačov. Vďaka tomu sa ich cena stáva porovnateľnou s iným typom gradientových systémov - systémami s tvorbou gradientného zloženia mobilnej fázy na vysokotlakovom potrubí.

Zásadným rozdielom medzi systémami s tvorbou gradientového zloženia mobilnej fázy vo vysokotlakovom potrubí je miešanie komponentov vo vysokotlakovom potrubí, prirodzene, pri tomto prístupe je počet presných čerpadiel určený počtom nádrží na miešanie. mobilná fáza. Týmto prístupom sa výrazne znižujú požiadavky na dôkladnosť odplynenia komponentov.

Schéma gradientového chromatografu s tvorbou gradientu zloženia mobilnej fázy na vysokotlakovej linke.

Mobilná fáza z nádrží (1) cez vstupné filtre (9) je dodávaná presnými vysokotlakovými čerpadlami (2 a 11) cez statický alebo dynamický prietokový mixér (10) do systému vstrekovania vzoriek (3) - manuál injektor alebo autosampler, kde sa vzorka tiež vstrekuje. Prevádzka riadených čerpadiel je riadená buď riadiacim modulom systému (hlavné čerpadlo alebo ovládač) alebo riadiacim programom PC. V tomto prípade sú všetky čerpadlá riadené. Systémy tohto typu tvoria binárny alebo trojrozmerný gradient. Forma funkcie spracovania gradientu závisí od konkrétneho riadiaceho modulu alebo riadiaceho programu, ako aj od funkčnosti riadeného a riadiaceho modulu. Ďalej cez in-line filter (8) vstupuje vzorka s prúdom mobilnej fázy do separačného prvku (prvkov) (4) - cez predkolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a je odstránený do odtokovej nádrže (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaregistruje a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od vyhotovenia funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (spravidla ovládač čerpadla alebo systému), alebo riadiacim programom z osobného počítača. V prípade ovládania riadiaceho modulu je možné samostatne ovládať detektor z vlastnej klávesnice.

Navrhované schémy sú dosť zjednodušené. Do systémov možno zaradiť ďalšie zariadenia - stĺpcový termostat, postkolónové derivatizačné systémy, systémy prípravy a koncentrácie vzoriek, recyklátor rozpúšťadiel, membránové systémy na potlačenie elektrickej vodivosti pozadia (pre iónovú chromatografiu), prídavné ochranné systémy (filtre, kolóny) , atď. V diagramoch nie sú manometrické moduly zobrazené samostatne. Spravidla sú tieto zariadenia zabudované do čerpacích jednotiek. Tieto jednotky môžu kombinovať viacero čerpadiel, čerpadlo s gradientovým programátorom a spoločný systémový ovládač. Štruktúra systému závisí od jeho konfigurácie a každého konkrétneho výrobcu.

Takáto radikálna komplikácia technického zabezpečenia chromatografického procesu vedie k vzniku množstva požiadaviek na vlastnosti mobilnej fázy, ktoré v klasickej kolónovej a planárnej chromatografii absentujú. Kvapalná fáza musí byť vhodná na detekciu (byť priehľadná v danej oblasti spektra alebo mať nízky index lomu, určitú elektrickú vodivosť alebo permitivitu atď.), inertná k materiálom častí chromatografického traktu, nesmie tvoriť plynové bubliny vo ventiloch čerpadla a detekčnej cele neobsahujú mechanické nečistoty.

V kvapalinovej chromatografii používa sa veľa druhov čerpadiel. Nízkotlaková LC často používa peristaltické čerpadlá (obrázok 1).

Obr.1 MasterFlex programovateľné peristaltické čerpadlo.

Pri HPLC sa používajú vysokotlakové čerpadlá na zabezpečenie prietoku mobilnej fázy kolónou so špecifikovanými parametrami.

Najdôležitejšie technické charakteristiky čerpadiel HPLC sú: rozsah prietoku; maximálny pracovný tlak; reprodukovateľnosť toku; rozsah pulzácie dodávky rozpúšťadla.

Podľa princípu činnosti sú čerpadlá HPLC rozdelené na striekačka a ďalej piest recipročné .

Injekčné pumpy

Hlavným rozlišovacím znakom týchto čerpadiel je ich cyklická prevádzka, a preto sa v cyklickej prevádzke líšia aj chromatografy, v ktorých sú tieto čerpadlá použité.

Ryža. 2. Hlavné usporiadanie injekčnej pumpy pre HPLC.

Ryža. 2A. Injekčná pumpa.

Riadiaca jednotka BU napája motor D napätím, ktoré určuje rýchlosť a smer jeho otáčania. Otáčanie motora pomocou prevodovky P sa premieňa na pohyb piestu P vo vnútri valca D. Čerpadlo pracuje v 2 cykloch. V plniacom cykle je ventil K2 zatvorený, K1 otvorený, rozpúšťadlo prúdi z nádrže do valca C. V režime zásobovania je ventil K1 zatvorený a cez ventil K2 vstupuje mobilná fáza do dávkovacieho zariadenia.

Čerpadlá tohto typu sa vyznačujú takmer úplnou absenciou pulzácií v toku mobilnej fázy počas prevádzky.

Nevýhody čerpadla:

a) vysoká spotreba času a rozpúšťadla na umývanie pri výmene rozpúšťadla;

b) objem PF obmedzený objemom striekačky, a teda obmedzený čas separácie;

c) pozastavenie separácie počas plnenia čerpadla;

d) veľké rozmery a hmotnosť pri zabezpečení vysokého prietoku a tlaku (potrebujete silný motor a veľkú silu piestu pri jeho veľkej ploche).

Piestové piestové čerpadlá.

Ryža. 3. Hlavné zariadenie piestového čerpadla.

Princíp fungovania.

Motor D cez prevodovku R vratne pohybuje piestom P a pohybuje sa v pracovnej hlave čerpadla. Ventily K1 a K2 sa otvárajú, keď je čerpadlo vo fáze nasávania a výtlaku. Množstvo objemového posuvu je určené tromi parametrami: priemer piestu (zvyčajne 3,13; 5,0; 7,0 mm), jeho amplitúda (12-18 mm) a frekvencia (ktorá závisí od rýchlosti otáčania motora a prevodovky).

Čerpadlá tohto typu zabezpečujú konštantný objemový prietok mobilnej fázy po dlhú dobu. Maximálny pracovný tlak 300-500 atm, prietok 0,01-10 ml/min. Opakovateľnosť podávania objemu -0,5 %. Hlavnou nevýhodou je, že rozpúšťadlo je privádzané do systému vo forme série po sebe nasledujúcich impulzov, takže dochádza k pulzáciám tlaku a prietoku (obr. 4). To je hlavný dôvod zvýšeného šumu a znecitlivenia takmer všetkých detektorov používaných v LC, najmä elektrochemických.

Obr.4. Pulzácia piestového čerpadla.

Spôsoby, ako sa vysporiadať s pulzáciami.

1. Aplikácia tlmiacich zariadení.

Sú to špirálové rúrky špeciálneho profilu vyrobené z nehrdzavejúcej ocele, zaradené sériovo alebo paralelne do systému medzi pumpu a dávkovač.

Ryža. 5. Špirálový tlmič.

Klapka je neskrútená so zvýšením tlaku v nej (zrýchlenie čerpadla). Pri poklese tlaku sa krúti, zmenšuje sa jeho objem, vytláča časť rozpúšťadla, pričom udržiava konštantný prietok a znižuje pulzácie. Takýto tlmič funguje dobre pri tlaku 50 atm a viac.

Pri tlaku 5-30 atm lepšie vyhladzuje pulzácie vzduchová klapka, vyrobený zo stĺpika (obr. 6.). Vzduch v upchatej kolóne (6x200 mm) je stlačený a pulzácie sú uhasené. Vzduch v ňom sa rozpustí za 24 hodín.

Ryža. 6. Vzduchová klapka.

2. Používanie elektronických zariadení.

Pri použití elektronického prevodníka tlaku možno údaje z prevodníka použiť na riadenie prevádzky čerpadla. Pri poklese tlaku sa otáčky motora zvýšia a vykompenzujú pokles tlaku. Je tiež možné kompenzovať netesnosti vo ventiloch a čiastočne v manžetách. Použitie elektronického tlmiča (BPZh-80, KhPZh-1 atď.) Umožňuje znížiť tlakové pulzácie na 1 atm pri tlaku 100-150 kgf / cm2.

1.6.3. Iónová výmena, iónová, iónovo-párová chromatografia. Metódy iónovej výmeny, iónovej a iónovo-párovej chromatografie sú založené na dynamickom procese nahrádzania iónov spojených so stacionárnou fázou elučnými iónmi vstupujúcimi do kolóny. Hlavným cieľom chromatografického procesu je separácia anorganických alebo organických iónov rovnakého znamienka. Retencia pri týchto typoch chromatografie je určená zmenou voľnej energie iónomeničovej reakcie. Pomer koncentrácií výmenných iónov v roztoku a v sorbentovej fáze je charakterizovaný iónomeničovou rovnováhou. Iónová výmena spočíva v tom, že niektoré látky (iónomeniče), keď sú ponorené do roztoku elektrolytu, absorbujú z neho katióny alebo anióny, pričom do roztoku uvoľňujú ekvivalentné množstvo iných iónov s nábojom rovnakého znamienka. Medzi katexom a roztokom dochádza k výmene katiónov, medzi aniónomeničom a roztokom k výmene aniónov.

Katiónomeniče sú najčastejšie špeciálne syntetizované nerozpustné polymérne látky obsahujúce vo svojej štruktúre kyslé ionogénne skupiny: -SO 3 H; -COOH; -OH; -P03H2; -As03H2.

Chemické vzorce katexov možno schematicky znázorniť ako R-S03H; R-S03Na. V prvom prípade je katex v H-forme, v druhom v Na-forme. R je polymérna matrica.

Katiónové výmenné reakcie sú napísané ako bežné heterogénne chemické reakcie:

RN + Na + RNa + H+

Aniónomeniče obsahujú vo svojej štruktúre základné ionogénne skupiny: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + atď. Ich chemické vzorce môžu byť vyjadrené ako RNH3OH a RNH3Cl alebo ROH, RCl. V prvom prípade je aniónomenič vo forme OH, v druhom vo forme Cl. Reakciu výmeny aniónov možno zapísať takto:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Sú známe amfotérne iónomeniče, ktoré vo svojej štruktúre obsahujú kyslé aj zásadité skupiny. Iónomeniče, ktoré majú vo svojom zložení rovnaký typ (napríklad SO 3 H) kyslé (bázické) skupiny, sa nazývajú monofunkčné; iónomeniče obsahujúce heterogénne (napr. - SO 3 H, - OH) kyslé (bázické) skupiny - polyfunkčné.

Monofunkčné iónomeniče sa získavajú polymerizačnou reakciou. Polykondenzačná reakcia umožňuje získať polyfunkčné iónomeniče. Aby výsledné iónomeniče mali dostatočne vysoké výkonové charakteristiky, musia byť nerozpustné, ale napučiavajúce vo vhodnom rozpúšťadle a musia mať dostatočne veľký počet ionogénnych skupín schopných výmeny s ionogénnymi skupinami analyzovanej vzorky. To sa dá dosiahnuť, ak sú výsledné polymérne reťazce dostatočne rozvetvené a navzájom spojené "zosieťovacími mostíkmi". Napríklad pri príprave katexov polymerizačného typu na báze styrénu sa ako sieťovadlo najčastejšie používa divinylbenzén, ktorého zavedenie v množstve do 16 % zabezpečuje výrobu iónomeničov s rôznym stupňom napučiavania a napr. preto umožňuje kontrolovať pórovitosť iónomeniča. Stupeň napučania iónomeniča, vyjadrený v mililitroch/gram, je objem 1 g vzduchom vysušeného iónomeniča naplneného do kolóny.

Iónomenič spravidla absorbuje jeden z protiiónov - iónov v mobilnej fáze, t.j. vykazuje určitú selektivitu. Experimentálne boli stanovené série afinity alebo selektivity iónov vzhľadom na iónomeniče rôznych typov. Napríklad pri nízkych koncentráciách roztoku na silne kyslých katexoch sa ióny s rovnakým nábojom sorbujú v nasledujúcom poradí:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Pre ióny s rôznym nábojom sa sorbovateľnosť zvyšuje so zvyšujúcim sa nábojom:

Na+Ca2+

Avšak zmena podmienok na uskutočnenie iónomeničovej reakcie môže viesť k sériovej inverzii. Afinitné série boli tiež stanovené pre anexy. Napríklad sorbovateľnosť aniónov na silne zásaditých anexoch sa zvyšuje v sérii:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 -.

Iónomeniče obsahujúce vo svojej štruktúre silne kyslé alebo silne zásadité skupiny vstupujú do iónomeničových reakcií s akýmikoľvek iónmi v roztoku, ktoré majú náboje rovnakého znamienka ako znamienko protiiónu. Takéto iónomeniče sa nazývajú univerzálne.

Proces iónovej výmeny medzi analytom a iónomeničom sa môže uskutočniť jedným z troch spôsobov: statickým, dynamickým (metóda iónomeničového filtra) a chromatografiou.

Statická metóda iónová výmena spočíva v tom, že vzorka iónomeniča sa privedie do kontaktu s určitým objemom roztoku a určitý čas sa mieša alebo pretrepáva, kým sa nenastolí rovnováha. Ide o rýchlu a jednoduchú metódu iónovej výmeny, ktorá sa používa na koncentráciu iónov zo zriedených roztokov, odstránenie nežiaducich nečistôt, ale nezabezpečuje úplnú absorpciu iónov, pretože iónová výmena je nerovnovážny proces, a preto nezaručuje úplné oddelenie. iónov.

Pri vykonávaní výmeny iónov dynamickým spôsobom kolónou s iónomeničom prechádza roztok, ktorý sa pri pohybe po kolóne dostáva do kontaktu s novými granulami iónomeniča. Tento proces poskytuje úplnejšiu výmenu ako statická metóda, pretože produkty výmeny sa odstraňujú prúdom roztoku. Môžu koncentrovať ióny zo zriedených roztokov a oddeľovať ióny, ktoré sa veľmi líšia vlastnosťami, napríklad rôzne nabité ióny (oddelené katióny od aniónov), ale oddelenie iónov s rovnakým nábojovým znakom je takmer nemožné. Kvantitatívna separácia takýchto iónov je možná len pri opakovanom opakovaní sorpčno-desorpčných elementárnych aktov za dynamických podmienok, t.j. chromatografická metóda . Pri práci s touto metódou sa používajú vysoké vrstvy iónomeniča a zmes, ktorá sa má separovať, sa zavádza do tejto vrstvy v množstve oveľa menšom, ako je kapacita kolóny, čím je zabezpečené opakované opakovanie základných úkonov iónovej výmeny. .

Podľa analytickej techniky je iónovo-výmenná chromatografia podobná molekulárnej chromatografii a môže sa vykonávať podľa možností eluentu (vyvíjacieho), čelného a vytesňovacieho. Rozdiel medzi molekulárnou a iónovo-výmennou chromatografiou je v tom, že pri molekulárnej chromatografii sa oddelené zložky zmesi vymývajú z kolóny čistým eluentom, zatiaľ čo pri iónovo-výmennej chromatografii sa ako eluent používa roztok elektrolytu. V tomto prípade by sa vymenený ión eluentu mal sorbovať menej selektívne ako ktorýkoľvek z iónov zo separovanej zmesi.

Pri najčastejšie používanej vyvolávacej iónomeničovej chromatografii sa kolóna naplnená iónomeničom najskôr premýva roztokom elektrolytu, kým iónomenič úplne nenahradí všetky svoje ióny iónmi obsiahnutými v eluente. Potom sa do kolóny zavedie malý objem roztoku analytu, ktorý obsahuje oddeliteľné ióny v množstve asi 1 % kapacity iónomeniča. Potom sa kolóna premyje elučným roztokom, odoberú sa frakcie eluátu a analyzujú sa.

Zmes Cl - , Br - , J - iónov je možné separovať na vysoko zásaditej aniónomeničovej živici (zosieťovaný polystyrén obsahujúci skupiny kvartérnych amóniových báz N (CH 3) 3 +), napríklad AB-17, ktorý má rozsah selektivity (selektivity): NO 3 - Cl – Br – J – . V dôsledku toho sa ako eluent použije roztok NaN03. Najprv tento roztok prechádza cez iónomenič, kým nie je úplne nasýtený iónmi NO 3 -. Keď sa zmes, ktorá sa má separovať, zavádza do kolóny, ióny Cl –, Br –, J – sú absorbované meničom aniónov, čím sa vytlačia ióny NO 3 –. Pri následnom premývaní kolóny roztokom NaNO 3 sú ióny Cl – , Br – , J – v horných vrstvách aniónomeniča postupne opäť nahradené iónmi NO 3 –. Ióny Cl - budú vytesňované najrýchlejšie zo všetkých, ióny J - zostanú v stĺpci najdlhšie. Rozdiel v selektivite iónomeniča k iónom zmesi vedie k tomu, že v kolóne sa vytvárajú samostatné zóny adsorbovaných iónov Cl – , Br – a J –, ktoré sa kolónou pohybujú rôznou rýchlosťou. Ako sa pohybujete pozdĺž stĺpca, vzdialenosť medzi zónami sa zvyšuje. V každej zóne je len jeden z aniónov zmesi, ktorá sa oddeľuje a anión eluentu, v intervale medzi zónami je len anión eluentu. V eluente na výstupe z kolóny sa teda objavia frakcie obsahujúce jednotlivé zložky zmesi, ktorá sa má oddeliť.

Pre riešenie praktických problémov sa podmienky separácie iónov menia výberom vhodnej mobilnej fázy (zloženie, koncentrácia, pH, iónová sila) alebo zmenou pórovitosti polymérnej matrice iónomeniča, tj počtu medzireťazcových väzieb v matricu a vytváranie iónomeničových sít, ktoré sú priepustné pre niektoré ióny a schopné ich výmeny a nepreniknuteľné pre iné. Je tiež možné zmeniť povahu a vzájomné usporiadanie ionogénnych skupín, ako aj získať sorbenty schopné selektívnych chemických reakcií v dôsledku tvorby komplexov. Vysokú selektivitu majú napríklad komplexotvorné iónomeniče obsahujúce vo svojej štruktúre chelatačné skupiny organických činidiel dimetylglyoxím, ditizón, 8-hydroxychinolín atď., ako aj korunové étery.

Najväčšie uplatnenie v iónomeničovej, iónovej a iónovej párovej chromatografii sa nachádza v syntetických makro- a mikronetových organických iónomeničoch s veľkou výmennou kapacitou (3–7 mmol/g), ako aj v anorganických iónomeničových materiáloch. Mikrosieťové iónomeniče sú schopné vymieňať ióny iba v napučanom stave, zatiaľ čo makrosieťové sú schopné vymieňať ióny v napučanom a nenapučanom stave. Ďalším konštrukčným typom iónomeničov sú povrchovo-vrstvové iónomeniče, ktorých pevné jadro je vyrobené z neporézneho kopolyméru styrénu a divinylbenzénu, skla alebo silikagélu a je obklopené tenkým filmom iónomeniča. Celkový priemer takejto častice je približne 40 um a hrúbka filmu iónomeniča je 1 um. Nevýhodou takýchto iónomeničov je relatívne veľký priemer častíc a nízka výmenná kapacita v dôsledku nízkeho špecifického povrchu, v dôsledku čoho je potrebné pracovať s malými vzorkami a teda používať vysoko citlivé detektory. Okrem toho sa takéto iónomeniče rýchlo otrávia a nie sú schopné regenerácie.

Vo vysokovýkonnej iónomeničovej a iónovej chromatografii sa používajú objemovo-porézne polystyrénové iónomeniče, objemovo-porézne oxidy kremičité s priemerom granúl asi 10 μm a prakticky nenapučiavajúce povrchovo pórovité a povrchovo modifikované kopolyméry styrénu a divinylbenzénu s ionogénnymi používajú sa sulfo a aminoskupiny.

Pri iónovo-párovej chromatografii sa používajú "kefkové" sorbenty - silikagély s naočkovanými reverznými fázami C 2, C 8, C 18, ktoré sa po absorpcii iónových tenzidov z mobilnej fázy ľahko premieňajú na katexové tenzidy, napr. sírany alebo soli kvartérnych amóniových zásad.

Pri chromatografickej separácii na iónomeničoch sa ako mobilná fáza najčastejšie používajú vodné roztoky solí. Je to spôsobené tým, že voda má vynikajúce rozpúšťacie a ionizačné vlastnosti, vďaka ktorým sa molekuly analyzovanej vzorky okamžite disociujú na ióny, iónomeničové skupiny iónomeniča sú hydratované a tiež prechádzajú do úplne alebo čiastočne disociovanej formy. To zaisťuje rýchlu výmenu protiiónov. Elučnú silu mobilnej fázy ovplyvňuje najmä pH, iónová sila, charakter tlmivého roztoku, obsah organického rozpúšťadla alebo povrchovo aktívnej látky (iónovo-párová chromatografia).

Hodnota pH sa volí v závislosti od povahy ionogénnych skupín, iónov, ktoré sa majú oddeliť, a matrice. So silne kyslými a silne zásaditými iónomeničmi je možné pracovať pri pH = 2–12, so slabo kyslými pri pH = 5–12 a so slabo zásaditými pri pH = 2–6. Sorbenty na báze oxidu kremičitého nemožno použiť pri pH 9. Iónová sila mobilnej fázy ovplyvňuje kapacitu iónomeniča. So zvýšením iónovej sily sa sorpcia iónov zvyčajne znižuje, pretože sa zvyšuje elučná sila mobilnej fázy. Na začiatku separácie by preto mala mať mobilná fáza nízku iónovú silu (0,05–0,1) a výsledná hodnota tejto charakteristiky by nemala presiahnuť 2. Pri gradientovej elúcii sa často používajú tlmivé roztoky so zvyšujúcou sa iónovou silou.

Na selektívnu elúciu iónov absorbovaných iónomeničom možno použiť vodu, tlmiace roztoky (fosfát, acetát, boritan, hydrouhličitan atď.) s určitou hodnotou pH a iónovou silou, roztoky minerálov (chlorovodíkový, dusíkatý, sírový, atď.). fosforečná) a organické (fenol, citrónová, mliečna, vínna, šťaveľová, EDTA) kyseliny. Výber eluentu uľahčuje skutočnosť, že limitné koeficienty distribúcie väčšiny prvkov medzi vodné (vodo-organické) roztoky mnohých komplexantov a štandardné iónomeniče sú určené a uvedené v tabuľkách.

1.6.4. Veľkostne vylučovacia chromatografia. Veľkostná vylučovacia chromatografia je typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej je separácia zložiek založená na distribúcii molekúl podľa ich veľkosti medzi rozpúšťadlom v póroch sorbentu a rozpúšťadlom prúdiacim medzi jeho časticami. Pri separácii malé molekuly vstupujú do polymérnej siete, v ktorej póroch slúži rozpúšťadlo ako stacionárna fáza, a tam sa zadržiavajú. Veľké molekuly nedokážu preniknúť do polymérnej siete a mobilnou fázou sa z kolóny vymyjú. Najprv sa eluujú najväčšie molekuly, potom stredné a nakoniec malé.

Vylučovacia chromatografia je rozdelená na gélovú permeáciu a gélovú filtráciu. Pri gélovej permeačnej chromatografii dochádza k separácii na polyméroch, ktoré napučiavajú v organických rozpúšťadlách. Verzia vylučovacej chromatografie s gélovou filtráciou zahŕňa použitie vo vode napučiavajúcich polymérov ako stacionárnych fáz.

Trvanie zadržania zložiek analyzovanej vzorky vo veľkostnej vylučovacej kolóne závisí od veľkosti ich molekúl a difúzie do pórov sorbentu, ako aj od veľkosti pórov stacionárnej fázy.

Pri tomto type kvapalinovej chromatografie rozdeľovací koeficient D pre najmenšie molekuly analyzovanej vzorky, ktoré sa v chromatografickej kolóne pohybujú najnižšou rýchlosťou a prenikajú do mriežky stacionárnej fázy, sa rovná 1, pretože mobilná fáza a rozpúšťadlo v póroch stacionárnej fázy majú rovnaké zloženie. V tomto prípade má hlavná rovnica stĺpcovej chromatografie tvar

Veľké molekuly, ktoré nevstupujú do pórov stacionárnej fázy, sú z kolóny eluované spolu s mobilnou fázou. Pre nich D= 0, a V R =V m. Takýto rozsah hodnôt distribučných koeficientov (od 0 do 1) je typický len pre vylučovaciu chromatografiu.

Všetky molekuly analyzovanej viaczložkovej látky by sa mali z kolóny vymyť prechodom malého objemu rozpúšťadla V m predtým V m +V s a separácia je dokončená pred výstupom píku rozpúšťadla. Preto je pri tomto type chromatografie potrebné použiť dostatočne dlhé kolóny s veľkým voľným objemom. V m a veľké množstvo pórov v sorbente.

Rozlíšenie chromatografických píkov pri separáciách podľa veľkosti sa môže zlepšiť použitím gradientovej elúcie so zmiešanými rozpúšťadlami.

Každý sorbent používaný pri vylučovacej chromatografii sa vyznačuje určitým objemom pórov, a preto má určitú oblasť oddeliteľných molekulových hmotností a určitú kalibračnú krivku. V tomto prípade má kalibračná krivka charakterizujúca závislosť zadržaného objemu od molekulovej hmotnosti alebo veľkosti molekúl spravidla komplexný tvar.

Stacionárne fázy vo veľkostnej vylučovacej chromatografii sa vyberajú na základe špecifických analytických úloh. Najprv sa stanoví, ktorý systém rozpúšťadiel sa môže použiť na analýzu (vodný alebo vodno-organický). V závislosti od toho sa určuje typ sorbentu. Ak sa majú oddeliť vo vode rozpustné vzorky, používajú sa ako stacionárne fázy napríklad vodou napučiavajúce zosieťované dextrány (Sephadex) alebo polyakrylamidy (Biogel P). Separáciu látok rozpustných v organických rozpúšťadlách je možné realizovať na polystyrénoch s rôznym stupňom zosieťovania, ktoré napučiavajú v organických rozpúšťadlách (styrogel, poragel, biobid C). Takéto napučané gély vo všeobecnosti nie sú tlakovo stabilné a umožňujú veľmi nízke prietoky mobilnej fázy, čo predlžuje čas analýzy. Pre realizáciu vysoko efektívnej verzie vylučovacej chromatografie je potrebné použiť stacionárne fázy s tuhými matricami - silikagélmi, ktorých nevýhoda - vysoká adsorpčná aktivita - je eliminovaná silanizáciou povrchu alebo výberom eluentu vhodnej polarity. .

Látky, ktoré možno použiť ako mobilné fázy pri vylučovacej chromatografii, sú:

 úplne rozpustiť analyzovanú vzorku;

 dobre navlhčite sorbent;

 pôsobiť proti adsorpcii zložiek vzorky na sorbente;

 majú nízku viskozitu a toxicitu.

1.6.5. Planárna chromatografia. Planárna chromatografia zahŕňa tenkovrstvovú a papierovú chromatografiu. Tieto typy kvapalinovej chromatografie sú technicky jednoduché, expresné, nevyžadujú drahé vybavenie, čo je ich nespornou výhodou.

Separáciu zmesi látok týmito metódami je možné uskutočniť pomocou rôznych chromatografických systémov. Preto sa rozlišuje adsorpcia, distribúcia, normálna a reverzná fáza, iónová výmena atď., papierová a tenkovrstvová chromatografia. V súčasnosti je najpoužívanejšia tenkovrstvová chromatografia.

Papierová a tenkovrstvová chromatografia sú v technike podobné. Celulózové papierové vlákno sa používa ako stacionárna fáza v papierovej chromatografii, v tenkovrstvovej chromatografii - rôzne sorbenty (Al 2 O 3, silikagél a pod.) uložené v rovnomernej tenkej (100-300 μm) vrstve na skle, kov alebo plastový substrát (nosič) . Adsorpčná vrstva na nosiči môže alebo nemusí byť fixovaná.

Chromatografická separácia v rovinných metódach, ako aj na kolóne, je spôsobená prenosom zložiek analytu mobilnou fázou pozdĺž vrstvy stacionárnej fázy rôznymi rýchlosťami v súlade s distribučnými koeficientmi látok, ktoré sa majú separovať. . V oboch prípadoch sa používajú chromatografické systémy kvapalina-tuhý sorbent (mechanizmus adsorpčnej separácie), nosič kvapalina-kvapalina-pevná látka (distribúcia, iónomenič a iné mechanizmy).

Ako mobilné fázy sa používajú rôzne rozpúšťadlá alebo ich zmesi, organické alebo anorganické kyseliny.

Praktické získavanie planárnych chromatogramov spočíva v nasledujúcom.

Na prúžku chromatografického papiera alebo na tenkej vrstve sorbentu sa ceruzkou vyznačí štartovacia čiara vo vzdialenosti 1 cm od spodného okraja prúžku alebo platne. Mikropipeta sa používa na nanesenie vzorky na štartovaciu čiaru vo forme škvrny s priemerom nie väčším ako 2-3 mm. Potom sa okraj pásu alebo dosky spustí do nádoby s mobilnou fázou, ktorá sa nachádza v utesnenej komore. Keď mobilná fáza stúpa pozdĺž pásu alebo platne a dochádza k viacnásobným elementárnym dejom sorpcie-desorpcie, distribúcie medzi dve kvapalné fázy, iónovej výmeny atď., ktoré sú bežné v chromatografii, zložky analyzovanej zmesi sa oddelia. Proces zvyčajne pokračuje, kým rozpúšťadlo neprejde od štartovacej čiary 10 cm. Potom sa pásik alebo platňa vyberie z komory a vysuší. Ak sú zložky analytu sfarbené, poskytujú na chromatograme zodpovedajúce farebné škvrny. Na detekciu nezafarbených zložiek analytu sa musí vytvoriť chromatogram. Vytvorenie chromatogramu a detekcia zložiek vzorky sa môže uskutočniť rôznymi metódami a závisí od zloženia analyzovaných zmesí. Prejav je možné vykonať:

- Pomocou UV žiarenia. Metóda je použiteľná na detekciu látok schopných emitovať vlastné žiarenie (luminiscencia) vo viditeľnom rozsahu vlnových dĺžok pri pôsobení UV žiarenia;

 pomocou činidiel-vyvíjačov. Napríklad prítomnosť aminokyselín v analyzovanej zmesi možno detegovať pomocou ninhydrínu. Vysušený chromatogram sa ponorí do 0,2 % roztoku ninhydrínu v acetóne a potom sa vysuší. Škvrny zodpovedajúce rôznym zložkám zmesi získajú vizuálnu a spravidla špecifickú farbu pre každú látku;

- pomocou jódu. V tomto prípade sa detegovaný chromatogram vloží do nádoby, na dne ktorej sú kryštály jódu. Výpary jódu sú na škvrnách adsorbované silnejšie, vďaka čomu sú škvrny vizualizované. Jód je nešpecifické vývojové činidlo. Pomocou špecifických činidiel je možné nielen určiť počet zložiek zmesi, ale aj identifikovať oddelené látky podľa farby škvŕn.

Papierová a tenkovrstvová chromatografia sa najčastejšie uskutočňuje v takzvanom vzostupnom variante opísanom vyššie. Pomerne často je na zlepšenie kvality chromatogramov potrebné použiť zložitejšie varianty planárnej chromatografie, napríklad zhora nadol, kruhovú, dvojrozmernú. Pri papierovej alebo tenkovrstvovej chromatografii sa analyt aplikuje na štartovaciu čiaru platne alebo papierového prúžku v hornej časti a eluent sa privádza zhora namiesto spodku. Pozitívny účinok zlepšenej separácie je spôsobený príspevkom gravitačných síl komponentov k procesu separácie.

Upstream aj downstream chromatografia sa môže uskutočňovať v jednorozmernej a dvojrozmernej verzii. Na rozdiel od vyššie opísaného jednorozmerného separačného procesu na plochom lôžku sa pri dvojrozmernej chromatografickej separácii najprv separácia analyzovanej vzorky uskutoční v jednom rozpúšťadle, potom sa separácia uskutoční v smere kolmom na prvé rozpúšťadlo pomocou iného rozpúšťadla, otočením prvého chromatogramu o 90 °C.

Pri kruhovej chromatografii sa analyt aplikuje ako kvapka do stredu platne alebo hárku chromatografického papiera. Tu sa tiež po kvapkách pridáva jedno alebo viac rozpúšťadiel. To vedie k tomu, že výsledný chromatogram je súborom radiálnych škvŕn.

Poloha škvŕn (zón), ktoré tvoria oddelené zložky analytu na plochom chromatograme, je charakterizovaná hodnotami relatívnej rýchlosti pohybu zložiek v tenkej vrstve. R fi. Experimentálna hodnota R fi definovaný ako pomer vzdialenosti L i, prešiel i-tá zložka, do diaľky L prešiel rozpúšťadlom zo štartovacej čiary do prednej línie (obr. 1.10):

Hodnota R fi závisí od charakteru príslušnej zložky analyzovanej vzorky, charakteru stacionárnej fázy, jej hrúbky, charakteru a kvality mobilnej fázy, spôsobu aplikácie vzorky a ďalších faktorov, ale vždy R fi 1.

Hodnota R fi je v skutočnosti identický s retenčným časom látky alebo jej retenčným objemom, ktorý charakterizuje rýchlosť prechodu látky cez chromatografickú kolónu a môže byť použitý na kvalitatívnu identifikáciu zložiek analyzovanej vzorky a priemer škvrny je identický do výšky alebo plochy chromatografického píku, a preto do určitej miery odráža kvantitatívny obsah látky.

Kvantitatívne určenie zloženia analyzovanej vzorky možno v najjednoduchšom prípade posúdiť vizuálne podľa intenzity vnútornej farby škvŕn alebo intenzity fluorescenčnej žiary škvŕn získanej pri UV detekcii. Na tieto účely sa široko používa elúcia chromatografických škvŕn. V tomto prípade sa škvrna získaná na chromatograme opatrne vyreže alebo zoškrabe, ošetrí sa vhodným rozpúšťadlom a výsledný roztok sa preskúma vhodnou fyzikálno-chemickou metódou. Môžete použiť aj gravimetrickú metódu, pri ktorej sa z chromatogramu vyreže a odváži zodpovedajúca škvrna. Množstvo látky je určené rozdielom hmotnosti čistého papiera rovnakej plochy a papiera s látkou.

Papier (BH ) a chromatografia na tenkej vrstve (TLC ) podľa separačného mechanizmu patrí deliaca chromatografia . Pri HD metóde je nosič špeciálny chromatografický papier s určitými vlastnosťami. Stacionárna fáza je voda adsorbovaná na povrchu a póroch papiera (do 20%), mobilná - organické rozpúšťadlo, miešateľná alebo nemiešateľná s vodou, vodou alebo roztokmi elektrolytov.

Mechanizmus na papieri dosť komplikované. V stacionárnej fáze môže byť látka zadržaná nielen v dôsledku rozpustenia vo vode adsorbovanej papierom, ale aj byť adsorbované celulózu priamo. Kreslené na papieri zdieľané komponenty prechádzajú do mobilnej fázy a pohybujú sa cez kapiláry papiera rôznymi rýchlosťami v súlade s koeficient rozdelenia na rozhraní každý z nich. Na začiatku chromatografia časť látky z papiera prejde do mobilná fáza a ísť ďalej. Keď organické rozpúšťadlo dosiahne oblasť papiera, ktorá neobsahuje rozpustenú látku, prerozdeľovanie : z organickej fázy látka prechádza do vodnej fázy, sorbovaná na papieri. Keďže komponenty majú rôzne afinitu k sorbentu , keď sa eluent pohybuje, dochádza k separácii: niektoré látky sú oneskorené na začiatku cesty, iné sa pohybujú ďalej. Tu sú kombinované termodynamické (ustanovenie rovnovážneho rozdelenia látok medzi fázami) a kinetická (pohybujúce sa komponenty rôznymi rýchlosťami) separačné aspekty. Výsledkom je, že každá zložka je sústredená na konkrétnu oblasť listu papiera: zóny jednotlivých komponentov na chromatogram . Použitie chromatografie na papieri má množstvo významných nevýhod: závislosť separačného procesu od zloženia a vlastností papiera, zmena obsahu vody v póroch papiera pri zmenách podmienok skladovania, veľmi nízka chromatografia rýchlosť (až niekoľko dní) a nízka reprodukovateľnosť výsledkov. Tieto nedostatky vážne ovplyvňujú rozšírenie papierovej chromatografie ako chromatografickej metódy.

V TLC metóda proces oddeľovania zmesi látok sa uskutočňuje v tenkej vrstve sorbent uložené na inertnom pevnom substráte a poskytnuté pohybom mobilná fáza (rozpúšťadlo) cez sorbent pri pôsobení kapilárne sily . Autor:separačný mechanizmus rozlišovať deliaca, adsorpčná a iónomeničová chromatografia . K separácii zložiek v týchto prípadoch dochádza buď v dôsledku ich rozdielneho distribučného koeficientu medzi dvoma kvapalnými fázami ( deliaca chromatografia ), alebo v dôsledku rozdielnej adsorbovateľnosti zlúčenín sorbentom ( adsorpčná chromatografia ). Adsorpčná metóda je založená na rôznych stupňoch sorpcie-desorpcie separovaných zložiek na stacionárnej fáze. Adsorpcia vykonávané na náklady van der Waalsove sily , čo je základ fyzikálna adsorpcia , polymolekulárne (tvorba niekoľkých adsorbátových vrstiev na povrchu adsorbentu) a chemisorpcia (chemická interakcia adsorbentu a adsorbátu).

V prípade použitia takých sorbentov pre TLC ako je napr oxid hlinitý alebo silikagél hrať úlohu pri odlúčení distribúcia a adsorpcia na vyvinutom aktívnom povrchu sorbentu (150–750 m2/g). Distribúcia zložky zmesi sa vyskytujú medzi vodou na povrchu nosiča (napr adsorbenty , ako oxid hlinitý , škrob , celulóza , kremelina - a voda formulár stacionárna fáza ) a rozpúšťadlo pohybujúce sa cez túto stacionárnu fázu ( mobilná fáza ). Zložka zmesi, ktorá je ľahšie rozpustná vo vode, sa pohybuje pomalšie ako tá, ktorá je ľahšie rozpustná v mobilnej fáze.

Adsorpcia sa prejavuje v tom, že medzi nosič napríklad oxid hlinitý a zložky zmesi sú nastavené adsorpčné rovnováhy - pre každú zložku svoj vlastný, výsledkom čoho je rozdielna cestovná rýchlosť zložky zmesi. Možno rozlíšiť dva extrémne prípady:

a) koncentrácia látky na adsorbente je nulová. Látka sa úplne rozpustí v mobilnej fáze a je ňou odnášaná (pohybuje sa spolu s rozpúšťadlové čelo ).

b) látka je úplne adsorbovaná, neinteraguje s rozpúšťadlom a zostáva na začiatku.

V praxi so zručným výberom rozpúšťadla a adsorbenta distribúcia zlúčeniny sa nachádzajú medzi týmito extrémnymi prípadmi a látka postupne prenesené z jednej vrstvy sorbentu do druhej v dôsledku súčasne prebiehajúcich procesov sorpcia a desorpcia .

Rozpúšťadlo prechádzajúce cez sorbent je tzv eluent , proces pohybu látky spolu s eluentom  elúcia . Pri pohybe kvapaliny po platni dochádza pôsobením síl k oddeľovaniu zmesi látok adsorpcia , distribúcia , iónová výmena alebo kombináciou všetkých týchto faktorov. V dôsledku toho oddelené chromatografické zóny zložky zmesi, t.j. ukázalo sa chromatogram .

Správny výber sorbent a eluent určuje účinnosť separácie zmesi. Mobilita testovanej látky závisí od jej afinity k sorbentu a elučná sila (polarita) eluentu. So zvyšujúcou sa polaritou zlúčeniny sa zvyšuje aj jej afinita k polárnemu sorbentu. Zvyšovaním stupňa adsorpcie silikagél organické zlúčeniny sú usporiadané v rade: uhľovodíky<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь pre silikagél eluenty môžu byť usporiadané vo vzostupnom poradí "polarity" ( elučná sila ) a tvoria sériu rozpúšťadiel ( eluotropný rad ) v súlade s experimentálnymi údajmi: alkány > benzén > chloroform > dietyléter > etylacetát > alkoholy С 2 -С 4 > voda > acetón > kyselina octová > metanol. Polárna zlúčenina, alkohol, je teda dosť silne adsorbovaná na silikagéli, a preto sa pri pôsobení takého nepolárneho rozpúšťadla, akým je hexán, pohybuje slabo a zostáva blízko štartovacej čiary. Nepolárny aromatický uhľovodík bifenyl je zase výrazne mobilnejší v hexáne, ale aj tu je možné dosiahnuť R f asi 0,5, je potrebný polárnejší aprotický eluent, metylénchlorid. sila eluentu regulovať pomocou zmesí rozpúšťadiel - susedov v eluotropný rad s rôznou polaritou.

V súčasnosti TLC používa hlavne nasledovné sorbenty : na oddelenie lipofilné látky  silikagél , oxid hlinitý , acetylovaná celulóza , polyamidy ; oddeliť hydrofilné látky  celulóza , celulózové iónomeniče , kremelina , polyamidy . Najdôležitejšou vlastnosťou sorbentu je jeho činnosť , t.j. schopnosť absorbovať (podržať) zložky zmesi, ktoré sa majú oddeliť. V zahraničí vyrába množstvo firiem silikagél , kremelina a oxid hlinitý s prídavkom 5% sadry, ktorá sa používa na fixáciu vrstvy sorbentu pri svojpomocnej výrobe platní.

Najbežnejším sorbentom je silikagél - hydratovaná kyselina kremičitá, vzniká pôsobením minerálnych kyselín na Na 2 SiO 3 a vysušením vzniknutého solu. Po zomletí sólu sa použije frakcia určitej veľkosti zrna (uvedená na štítku, zvyčajne 5-20 mikrónov). silikagél je polárny sorbent s OH skupinami ako aktívnymi miestami. Ľahko sorbuje vodu na povrchu a vytvára vodíkové väzby.

Alumina je slabo zásaditý adsorbent a používa sa najmä na separáciu slabo zásaditých a neutrálnych zlúčenín. Nevýhodou platní na oxide hlinitom je povinná aktivácia povrchu pred použitím v sušiarni pri vysokej teplote (100-150 o C) a nízka adsorpčná kapacita vrstvy v porovnaní so silikagélom.

kremelina - adsorbent získaný z prírodných minerálov - kremeliny. Sorbent má hydrofilné vlastnosti a nižšiu adsorpčnú kapacitu vrstvy v porovnaní so silikagélom.

Celulóza: tenkovrstvové platne potiahnuté celulózou sú veľmi účinné pri oddeľovaní zložitých organických molekúl. Adsorbentom sú najmä celulózové guľôčky s priemerom do 50 mikrónov, upevnené na nosiči škrobom. Rovnako ako pri papierovej chromatografii je vzostup čela rozpúšťadla veľmi pomalý.

Chromatografická analýza sa vykonáva na priemyselných platniach českej výroby“ Silufol » (« Silufol "") z hliníkovej fólie, niekedy vystuženej lepenkou, a " Siluplast » vyrobené z plastu potiahnutého vrstvou sorbentov - silikagél LS 5-40 so škrobom alebo sadrou ako spojivom (do 10%), alebo oxid hlinitý s alebo bez fluorescenčných indikátorov. záznamy " Silufol » majú vysokú rýchlosť elúcie, vyznačujú sa však nízkou separačnou silou a nízkou citlivosťou. Pri skladovaní sú citlivé na podmienky (vlhkosť, teplota, agresívne médiá a pod.). Dodávajú jednotlivé firmy chromatografické platne s vrstvou sorbentu rôznej (zvyčajne do 0,25 mm), ale prísne konštantnej hrúbky (silikagél, celulóza, iónomeničová živica), na skle a substrátoch z hliníkovej fólie, plastu, impregnovaného sklolaminátu.

taniere « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) sa vyrábajú v Rusku na polymérnej báze (polyetyléntereftalát, trieda P) alebo hliníkovom substráte (trieda AF) s nanesenou pracovnou vrstvou mikrofrakcionovaný silikagélový sorbent triedy STX-1A a STX-1VE (vyrábané v ZSSR ako frakcionovaný silikagél KSKG) s hrúbkou 90-120 mikrónov (do 200 mikrónov), fixované špeciálnym spojivom - silikásol . Pri použití sólu kyseliny kremičitej (silikazolu) ako spojiva, ktoré sa po zahriatí premení na silikagél, sa výsledné TLC dosky skladajú z dvoch zložiek: vrstvy silikagélu a substrátu. Rovnomernosť hrúbky vrstvy sorbentu na jednej platni je ±5 µm. Príklad označenia: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UF (10x10)" - vysokovýkonné TLC platne na hliníkovom substráte, s fosforom, 10x10 cm.

Ak sa použije sklenený substrát (trieda C), potom sú takéto platne opakovane použiteľné a chemicky odolné. Ich chemická odolnosť je určená chemickou odolnosťou silikagélu. Výsledkom je, že TLC platne môžu byť opakovane ošetrené agresívnymi činidlami, napríklad horúcou zmesou chrómu, čo odstraňuje obmedzenia týkajúce sa použitia korelačných činidiel na detekciu škvŕn a modifikáciu sorbentov a umožňuje viacnásobné (až 30-krát alebo viac) regenerácia platní zmesou chrómu. Sklenené dosky je možné rezať na požadovanú veľkosť. Mechanickú pevnosť vrstvy sorbentu je možné kontrolovať, čo na jednej strane poskytuje transport a viacnásobné spracovanie dosiek a na druhej strane možnosť extrakcie adsorbčných vrstiev s oddelenými látkami pre následné vymývanie jednotlivých zlúčenín z sorbentu a ich ďalšie štúdium inštrumentálnymi metódami (IR a UV spektrometria), röntgenové difrakčné metódy, NMR a pod.).

Doštičky sa líšia veľkosťou frakcií (distribúciou častíc) silikagélu, ktorý tvorí vrstvu. Na analytických platniach (trieda A) je frakcia 5-17 mikrónov, na vysoko účinných (trieda B) - 8-12 mikrónov. Užšia distribúcia zvyšuje účinnosť platní, t.j. škvrny látok, ktoré sa majú oddeliť, sa stanú kompaktnejšími (s menšou veľkosťou), a preto sa lepšie oddelia, keď čelo eluentu prejde kratšou vzdialenosťou. Na ruských doštičkách sa analytické a vysokovýkonné vrstvy veľmi nelíšia, na rozdiel od doštičiek od spoločnosti Merck (Nemecko). Ak látky nemožno oddeliť na analytických platniach, mali by sa použiť vysokovýkonné platne. Doštičky všetkých modifikácií sú vyrábané s fosforom (UV grade) s 254 nm excitáciou. Trvanlivosť nie je obmedzená, taniere " Sorbfil » široko testované pri analýze derivátov aminokyselín, pesticídov, lipidov, antibiotík.

Uskutočňuje sa TLC metóda kvalitatívna identifikácia komponentov. kvantifikácia pre TLC je tiež možné, to vyžaduje použitie presného množstva látky a ďalšie denzitometrické štúdie s jasnou fixáciou intenzity škvŕn. Najbežnejšie je semikvantitatívna metóda . Je založená na vizuálne porovnanie veľkosť a intenzita škvrny komponentu so zodpovedajúcimi charakteristikami série škvŕn tej istej látky rôznych koncentrácií ( štandardné referenčné roztoky ). Pri použití vzorky v množstve 1–5 μg poskytuje takáto jednoduchá metóda presnosť stanovenia obsahu zložky asi 5–10 %. Na stanovenie zložiek vo vzorke je často potrebné vykonať prípravu vzorky, aby sa získala zmes obsahujúca analyzované zlúčeniny. Príprava vzorky je založená na extrakcii liečiv zo vzorky organickými rozpúšťadlami ( n-hexán, petroléter, dietyléter, chloroform), čistenie extraktu a následná chromatografia na tenkej vrstve oxidu hlinitého alebo silikagélu.

Existuje niekoľko variantov TLC a BC, ktoré sa líšia spôsobom zásobovanie rozpúšťadlami . V závislosti od smeru pohybu mobilnej fázy existujú:

a)vzostupná chromatografia  mobilná fáza sa naleje na dno separačnej komory, papier (doska) sa položí vertikálne;

b)zostupná chromatografia  mobilná fáza sa privádza zhora a pohybuje sa nadol pozdĺž vrstvy sorbentu dosky alebo papiera;

v)radiálna chromatografia  horizontálny posun čela rozpúšťadla: mobilná fáza je privedená do stredu papierového kotúča (dosky), kde sa ukladá zmes, ktorá sa má oddeliť.

Najbežnejšie je vzostupná elúcia (chromatografia). Predné eluent pri pohybe zdola nahor. Výber rozpúšťadla (mobilnej fázy) je určený povahou sorbentu a vlastnosťami separovaných látok.

Chromatografická separácia Metódy BC a TLC sa uskutočňujú v separačná komora so skrutkovacím vekom. Kvantitatívne meranie rýchlosti prenosu látky pomocou špecifického adsorbenta a rozpúšťadla je R hodnota f (z angličtiny. zadržiavanie faktor – koeficient oneskorenia, tento parameter je obdobou retenčného času). pozícia zóny chromatografovaného komponentu nastaviť na veľkosť koeficient R f rovná pomeru rýchlosti jej zóny k rýchlosti čela rozpúšťadla. Hodnota R f je vždy menšia ako jednota a nezávisí od dĺžky chromatogramu. Podľa množstva R f ovplyvnené rôznymi faktormi. Takže pri nízkych teplotách sa látky pohybujú pomalšie; kontaminácia rozpúšťadla, nehomogenita adsorbenta, cudzie ióny v analyzovanom roztoku môžu zmeniť hodnotu R f až 10 %. Vo vybranom systéme musia mať analyty rôzne hodnoty R f a distribuované po celej dĺžke chromatogramu. Je žiaduce, aby hodnoty R f ležal v rozmedzí 0,05-0,85.

V praxi hodnota R f vypočítané ako pomer vzdialenosti l cestovaná látkou do diaľky L prešiel rozpúšťadlom:

R f = l/l (6.1 )

Zvyčajne pre výpočet vyberte spot centrum (obr. 1). Hodnota R f závisí od mnohých faktorov ako napr chromatografický papier (jej pórovitosť, hustota, hrúbka, stupeň hydratácie) a sorbent (veľkosť zŕn, charakter skupín na povrchu, hrúbka vrstvy, jej vlhkosť, povaha látky, zloženie mobilnej fázy), experimentálne podmienky (teplota, čas chromatografie a pod.). Pri stálosti všetkých parametrov chromatografie je hodnota R f určené iba individuálnymi vlastnosťami každého komponentu.

Ryža. 1. Stanovenie hodnôt na chromatograme RF pre komponenty A a V,

stupeň ich separácie Rs a počet teoretických etáp N .

Účinnosť BC a TLC závisí aj od selektivita a citlivosť reakcie používané na detekciu zložiek analyzovanej zmesi. Zvyčajne sa používajú činidlá, ktoré tvoria farebné zlúčeniny so zložkami, ktoré sa majú stanoviť - vývojky. Pre spoľahlivejšie identifikáciu zdieľaných komponentov uplatniť " svedkov » -riešenia štandardné látky (v rovnakom rozpúšťadle ako vzorka), o ktorých sa očakáva, že budú prítomné vo vzorke. Štandardná látka aplikovaný na štartovaciu čiaru vedľa analyzovanej vzorky a chromatografovaný za rovnakých podmienok. V praxi sa často používa relatívna hodnota:

R f rel = R f X / R f stáť (6.2)

kde R f stáť vypočítané aj podľa vzorca (6.1). Efektívnosť chromatografická separácia charakterizovať počet ekvivalentných teoretických etáp a oni výška . V metóde TLC teda počet ekvivalentných teoretických poschodí N A pre komponent A zmes, ktorá sa má oddeliť, sa vypočíta podľa vzorca:

N A = 16 (l OA / a (A )) 2 (6.3)

hodnoty l OA a a (A ) určené, ako je znázornené na obr. 6.1. Potom výška ekvivalentnej teoretickej dosky H A je:

H A = l OA /N = a (A ) 2 / 16 l OA . (6.4)

Oddelenie je prakticky možné, ak R f (A)  R f (V)  0,1 .

Charakterizovať oddelenie dvoch zložiek A a V použitie stupeň (kritérium) divízie Rs :

Rs =  l / (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l / (a (A) + a (B)) (6.5)

kde  l  vzdialenosť medzi stredmi bodov komponentov A a V;

a (A) a a (V)  bodové priemery A a V na chromatograme (obr. 6.1). Viac Rs tým jasnejšie sú škvrny komponentov oddelené A a V na chromatograme. Podmienky chromatografia sú zvolené tak, aby hodnota Rs odlišná od nuly a jednotky, optimálna hodnota Rs je 0,3  0,7. Pre sadzbu separačná selektivita dve zložky A a V použitie separačný faktor α :

α = l B / l A (6.6)

Ak α = 1, potom zložky A a V nie sú oddelené.